微生物限檢查方法驗(yàn)證方案

1、頁 碼： 第1頁，共12頁文件編碼： ZYCWJ-TS-07156-01起草部門：質(zhì)量管理部版本號：01標(biāo)題微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案起草人起草時間審核人審核時間批準(zhǔn)人批準(zhǔn)時間頒發(fā)部門質(zhì)量管理部生效日期分發(fā)部門份數(shù) 質(zhì)量管理部 生產(chǎn)部 設(shè)備部 物料部 行政人事部 銷售部 財務(wù)部 變更記載：修訂號批準(zhǔn)日期執(zhí)行日期變更原因微生物驗(yàn)證實(shí)施小組主要成員：部 門質(zhì)量管理部質(zhì)量管理部質(zhì)量管理部質(zhì)量管理部質(zhì)量管理部姓 名職 位驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組審查匯簽：姓 名部 門職務(wù)或崗位簽字日期企業(yè)負(fù)責(zé)人質(zhì)量管理部經(jīng)理生產(chǎn)部經(jīng)理設(shè)備部經(jīng)理質(zhì)量管理部QC主管質(zhì)量管理部QA主管物料部經(jīng)理1 概述藥典微生物限度檢查法中要求在建立藥

2、品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查。所以對感冒靈顆粒微生物限度檢查進(jìn)行方法的驗(yàn)證。2 目的為了保證檢驗(yàn)質(zhì)量，對所用的檢驗(yàn)方法必須經(jīng)過驗(yàn)證，才能確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。3 適用范圍 本方案適用于感冒靈顆粒微生物方法學(xué)的確認(rèn)與驗(yàn)證。4 驗(yàn)證人員職責(zé)4.1 驗(yàn)證小組:組長：質(zhì)量管理部經(jīng)理 成員：QC主管、微生物操作人員4.2 職責(zé)及分工：QC主管組織起草該驗(yàn)證方案，并組織實(shí)施該方案；微生物操作人員具體實(shí)施該方案；質(zhì)量管理部經(jīng)理協(xié)助和監(jiān)控該方案的實(shí)施。4.3 驗(yàn)證方案批準(zhǔn)后，應(yīng)進(jìn)行培訓(xùn)。由驗(yàn)證小組指定人員負(fù)責(zé)對小組成員及和驗(yàn)證有關(guān)的人員進(jìn)行培訓(xùn)。5

3、 驗(yàn)證依據(jù)中國藥典2015年版通則“1105”、“1106”6.感冒靈顆粒微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證風(fēng)險分析序號項(xiàng)目潛在的風(fēng)險分析潛在的失敗后果原因分析嚴(yán)重程度發(fā)生頻次風(fēng)險等級措施結(jié)果采取的措施嚴(yán)重程度發(fā)生頻次風(fēng)險等級1驗(yàn)證方案編寫人員編寫人員未按照ZYCWJ-SOP-10008-01微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編寫方案。驗(yàn)證方法錯誤，導(dǎo)致驗(yàn)證結(jié)果不可靠。人員培訓(xùn)考核不到位F2P3ALARP對驗(yàn)證編寫人員進(jìn)行培訓(xùn)和考核，合格后方可編寫F2P5ACC（可接受）2試驗(yàn)人員試驗(yàn)人員未按照編寫的驗(yàn)證方案進(jìn)行操作操作不正確，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不可靠人員培訓(xùn)考核不到位F2P3ALARP按照驗(yàn)證方案進(jìn)行培訓(xùn)，培訓(xùn)合格

4、后方可操作F2P5ACC（可接受）3培養(yǎng)箱、凈化工作臺儀器未經(jīng)校驗(yàn)或不在校驗(yàn)期內(nèi)。導(dǎo)致檢驗(yàn)環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境不符合要求，最終導(dǎo)致驗(yàn)證失敗。使用人員使用前未對校驗(yàn)期進(jìn)行檢查F2P3ALARP設(shè)備人員使用前對設(shè)備進(jìn)行檢查。F3P5ACC（可接受）4干熱滅菌烘箱、壓力蒸氣鍋儀器未經(jīng)校驗(yàn)或不在校驗(yàn)期內(nèi)。導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)異常。使用人員使用前未對校驗(yàn)期進(jìn)行檢查F2P3ALARP設(shè)備人員使用前對設(shè)備進(jìn)行檢查。F3P5ACC（可接受）5對照培養(yǎng)基、檢查用培養(yǎng)基、檢定菌對照培養(yǎng)基、檢查用培養(yǎng)基、檢定菌失效導(dǎo)致驗(yàn)證失敗使用前未對對照培養(yǎng)基、檢查用培養(yǎng)基、檢定菌有效期進(jìn)行核查。F2P3ALARP對管理人員進(jìn)行培訓(xùn)，嚴(yán)格

5、按照ZYCWJ-SMP-10020-00培養(yǎng)基及檢定菌管理規(guī)程進(jìn)行管理，使用前使用人對有效期進(jìn)行確認(rèn)。F3P5ACC（可接受）6培養(yǎng)基、緩沖液、消毒劑培養(yǎng)基、緩沖液、消毒劑配制不正確導(dǎo)致驗(yàn)證失敗嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求制備緩沖液和消毒劑F2P3ALARP對實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行驗(yàn)證培訓(xùn)F3P5ACC（可接受）7滅菌器具、潔凈服已滅菌器具和潔凈服過效期導(dǎo)致驗(yàn)證失敗使用前未對已滅菌器具和潔凈服有效期進(jìn)行確認(rèn)F2P3ALARP使用前對已滅菌器具和潔凈服有效期進(jìn)行確認(rèn)F3P5ACC（可接受）8驗(yàn)證方法不正確1、 驗(yàn)證方案編寫不正確；2、 未嚴(yán)格按照驗(yàn)證方案開展驗(yàn)證工作導(dǎo)致驗(yàn)證失敗驗(yàn)證方案未經(jīng)批準(zhǔn)F3P3ALARP對驗(yàn)證

6、方案進(jìn)行審核F3P5ACC（可接受）9控制菌檢驗(yàn)結(jié)果不合格實(shí)驗(yàn)組無菌落生長，供試品可能有抑菌性導(dǎo)致驗(yàn)證失敗1、供試品可能對試驗(yàn)菌存在抑制作用2、檢驗(yàn)員判斷失誤。F2P3ALARP采用培養(yǎng)基稀釋法消除抑菌性F3P5ACC（可接受）10實(shí)驗(yàn)組菌種回收率不達(dá)標(biāo)各試驗(yàn)組回收率低于或高于標(biāo)準(zhǔn)范圍導(dǎo)致驗(yàn)證失敗1、供試品可能對試驗(yàn)菌存在抑制作用2、檢驗(yàn)人員計數(shù)錯誤。F2P3ALARP采用培養(yǎng)基稀釋法消除抑菌性F3P5ACC（可接受）11樣品儲存環(huán)境樣品儲存環(huán)境、溫度異常。導(dǎo)致樣品被污染或失敗樣品存放不當(dāng)F2P3ALARP嚴(yán)格控制樣品存放環(huán)境的溫濕度F3P5ACC（可接受）12潔凈區(qū)環(huán)境1、潔凈區(qū)溫濕度、壓差

7、異常2、潔凈區(qū)環(huán)境被污染導(dǎo)致驗(yàn)證失敗1.潔凈區(qū)溫濕度、壓差控制不當(dāng)2.未定期對潔凈區(qū)進(jìn)行清潔和消毒；3.未定期監(jiān)測潔凈區(qū)的環(huán)境F2P3ALARP1. 每天定期監(jiān)察潔凈區(qū)的溫濕度；2. 按照SOP規(guī)定對潔凈區(qū)進(jìn)行消毒；3. 嚴(yán)格按照潔凈度監(jiān)測管理規(guī)程對潔凈區(qū)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測。F3P5ACC（可接受）6.1 結(jié)果分析：通過以上采取的措施，風(fēng)險均控制在可接受范圍內(nèi)。7. 人員培訓(xùn)確認(rèn)表培訓(xùn)時間培訓(xùn)內(nèi)容培訓(xùn)對象培訓(xùn)地點(diǎn)培訓(xùn)講師主辦部門被 培 訓(xùn) 人 員 簽 名序號姓名部門及崗位QA主管QC主管設(shè)備部經(jīng)理設(shè)備管理員生產(chǎn)部經(jīng)理質(zhì)量管理部QC檢驗(yàn)員質(zhì)量管理部QC檢驗(yàn)員質(zhì)量管理部QC檢驗(yàn)員質(zhì)量管理部QC檢驗(yàn)員8.

8、驗(yàn)證方法6.1 儀器及設(shè)備名稱儀器及設(shè)備名稱型號生產(chǎn)廠家是否校驗(yàn)備注生化培養(yǎng)箱是 否恒溫培養(yǎng)箱是 否凈化工作臺是 否超凈工作臺是 否立式壓力消毒器是 否立式壓力滅菌器是 否6.1驗(yàn)證用樣品： 感冒靈顆粒 規(guī)格： 批號：感冒靈顆粒 規(guī)格： 批號：感冒靈顆粒 規(guī)格： 批號：6.2 驗(yàn)證用培養(yǎng)基： 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基 生產(chǎn)廠家： 批號： 配制批號：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 生產(chǎn)廠家： 批號： 配制批號：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 生產(chǎn)廠家： 批號： 配制批號：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 生產(chǎn)廠家： 批號： 配制批號：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 生產(chǎn)廠家： 批號 ： 配制批號：麥康凱液體培養(yǎng)基 生產(chǎn)廠家： 批號 ： 配制批號：

9、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 生產(chǎn)廠家： 批號 ： 配制批號：6.3驗(yàn)證用菌種:金黃色葡萄球菌（CMCC(B)26 003）、大腸埃希菌（CMCC(B)44 102）、枯草芽孢菌（CMCC(B)63 501）、白色念珠菌（CMCC(F)98 001）、黑曲霉菌（CMCC(F)98 003）6.4菌液制備：取經(jīng)3035培養(yǎng)1824小時的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至105107為不大于100cfu/ml備用。取經(jīng)2025培養(yǎng)23天的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至105為不大于100

10、cfu/ml備用。將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)57天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液無菌試管內(nèi)用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液依次稀釋至，制成每1ml 含孢子數(shù)小于100cfu 的孢子懸液。 上述菌懸液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在28，可在24內(nèi)使用。6.5供試液制備:取樣品10g，加入pH7.0無菌氯

11、化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，為1：10供試液。7.計數(shù)方法的驗(yàn)證：7.1 需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)（平皿法）所加菌液的體積不得超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行計數(shù)方法適用性檢查。7.2試驗(yàn)組取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液、混勻，使每1ml供試液或每張濾膜過濾的供試液中含菌量不大于100cfu。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的銅綠假單胞菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。取的供試液9.9ml和小于1000

12、0cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。取的試液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢桿菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。取的供試液9

13、.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。 取的供試液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于2025倒置培養(yǎng)5天點(diǎn)計菌落數(shù)。平行制備2個平皿。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于2025倒置培養(yǎng)5天點(diǎn)計菌落數(shù)。平行制備

14、2個平皿。7.3 菌液組取小于100cfu的銅綠假單胞菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液各1ml，注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基約1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計菌落數(shù)。各平行制備2個平皿。 取小于100cfu的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液各1ml，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基各1520ml，混勻，凝固，于2025倒置培養(yǎng)5天點(diǎn)計菌落數(shù)。各平行制備2個平皿。7.4 供試品對照組取的供試液1ml，注入平皿中，分別立即傾注1520 ml溫度不超過45胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，

15、凝固，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計菌落數(shù)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基2025倒置培養(yǎng)5天點(diǎn)計菌落數(shù)。各組平行制備2個平皿。7.4計算公式：稀釋劑對照組的回收率= 稀釋劑對照組菌落數(shù)-供試品對照組菌數(shù) ×100% 菌液組菌落數(shù) 試驗(yàn)組菌數(shù)回收率= 試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對照組菌數(shù) ×100% 菌液組菌落數(shù) 7.5 判定標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組、稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率應(yīng)在0.52之間。若各試驗(yàn)菌的回收率均符合規(guī)定，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。7.6試驗(yàn)結(jié)果表1 平皿法驗(yàn)證結(jié)果1# 批號： 實(shí)驗(yàn)組別 試驗(yàn)菌種供試液對照組菌液組菌數(shù)

16、試驗(yàn)組菌數(shù)回收率（%）1號2號1號2號金黃色葡萄球菌大腸埃希菌 枯草芽孢桿菌黑曲霉白色念珠菌表2 平皿法驗(yàn)證結(jié)果2# 批號： 實(shí)驗(yàn)組別 試驗(yàn)菌種供試液對照組菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)回收率（%）1號2號1號2號金黃色葡萄球菌大腸埃希菌 枯草芽孢桿菌黑曲霉白色念珠菌表3 平皿法驗(yàn)證結(jié)果3# 批號： 實(shí)驗(yàn)組別 試驗(yàn)菌種供試液對照組菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)回收率（%）1號2號1號2號金黃色葡萄球菌大腸埃希菌 枯草芽孢桿菌黑曲霉白色念珠菌結(jié)果說明：8.控制菌檢查方法驗(yàn)證（1）大腸埃希菌 取1：10供試液10ml兩份，分別加入兩瓶100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，其中一瓶加入1ml大腸埃希菌液（不大于100cfu/

17、ml）為試驗(yàn)組；一瓶為供試品；另取一瓶100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入10ml無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為陰性對照。取上述培養(yǎng)物1ml，接種至含100ml 麥康凱液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，4244培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上3035培養(yǎng)1872小時。表10 大腸埃希菌常規(guī)法驗(yàn)證結(jié)果1# 批號：步驟實(shí)驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)1824小時麥康凱液體培養(yǎng)基，4244培養(yǎng)2448小時取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1872小時。若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判未檢出大腸埃希菌。表11 大腸埃希菌常規(guī)法驗(yàn)證結(jié)果2# 批號：步驟實(shí)驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)1824小時麥康凱液體培養(yǎng)基，4244培養(yǎng)2448小時取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1872小時。若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn), 確