PCR技術(shù)及其在動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用

1、PCR技術(shù)及其在動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域中的運(yùn)用摘要：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。近年來(lái)，PCR技術(shù)迅速發(fā)展并與其他技術(shù)結(jié)合衍生出了熒光定RT-PCR、PCR-DGGE，多重PCR等一系列新技術(shù)，運(yùn)用領(lǐng)域也不斷拓寬，已被廣泛地用于微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域。本文通過(guò)介紹PCR技術(shù)及其在動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域中的運(yùn)用，使讀者對(duì)PCR技術(shù)有初步的了解并對(duì)其運(yùn)用領(lǐng)域有概況性的認(rèn)識(shí)，更是為了今后的科學(xué)研究積累了更多的知識(shí)和提供了技術(shù)上的支持。關(guān)鍵詞：熒光定量PCR RT-PCR 探針 引物

2、（一）PCR技術(shù)簡(jiǎn)介及其運(yùn)用概述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（英文全稱：Polymerase Chain Reaction）， 簡(jiǎn)稱PCR。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何DNA、RNA的地方。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。1、PCR技術(shù)原理雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與

3、下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。2、PCR工作原理 類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至9095一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引

4、物的退火：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至5560，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于7075，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。3、PCR種類及運(yùn)用（1）、RT-PCR 原理：首先提起RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶與MRNA為模板進(jìn)行CDNA第一鏈的合成，其原理同PCR.。RT-PCR

5、是個(gè)半定量的試驗(yàn)，可以確定在MRNA水平的表達(dá)差異，即在轉(zhuǎn)錄水平 。（2）、免疫PCR(immuno polymerase chain reaction , IPCR ) 原理：是用一段已知DNA 分子標(biāo)記抗體作為探針,用此探針與待測(cè)抗原反應(yīng),PCR 擴(kuò)增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA 分子,電泳定性,根據(jù)特異性PCR 產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判斷待測(cè)抗原是否存在。免疫PCR是迄今最敏感的一種抗原檢測(cè)方法,理論上可以檢測(cè)單個(gè)抗原分子,但實(shí)踐中它的敏感性受許多因素的影響,如連接分子、顯示系統(tǒng)的選擇、DNA 報(bào)告分子的濃度、PCR 循環(huán)次數(shù)等。由于PCR 產(chǎn)物在抗原量未達(dá)到飽和前與抗原抗體復(fù)合物的量成正比

6、,因此免疫PCR 還可用于抗原的半定量試驗(yàn)。 （3）、巢式PCR 原理：是用內(nèi)外兩對(duì)引物擴(kuò)增拷貝數(shù)較低的片段。先用外引物進(jìn)行第一輪反應(yīng),將產(chǎn)物適當(dāng)?shù)南♂?然后用內(nèi)引物繼續(xù)擴(kuò)增. 巢式PCR比較適合微量DNA或者石蠟組織抽提的DNA 。（4）、實(shí)時(shí)熒光PCR 原理：利用熒光來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確確定CT值，從而確定其實(shí)DNA拷貝數(shù) 。實(shí)時(shí)PCR，屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時(shí)間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。實(shí)時(shí)PCR的定量使用熒光色素，目前有二種方法，一種是在ds DNA中插入特異的熒光色素，例如SYBR Green熒

7、光染料；另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結(jié)合的一種熒光探針（probe），如Taqman探針。兩種方法原理不同。SYBR Green熒光染料游離時(shí)不發(fā)光，當(dāng)反應(yīng)體系中存在雙鏈DNA時(shí)，SYBR Green與雙鏈DNA結(jié)合，此時(shí)才發(fā)光。Taqman探針帶有一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)連接在探針的5末端，而淬滅基團(tuán)則在3末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，此時(shí)熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)可以被檢測(cè)

8、到。real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結(jié)合，能用微量的RNA來(lái)找出特定時(shí)間、細(xì)胞、組織內(nèi)的特別表達(dá)的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱之為“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”。（5）、原位PCR技術(shù)：原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù)。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等。其基本方法為：固定組織或細(xì)胞：將組織細(xì)胞固定于預(yù)先

9、用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。蛋白酶K消化處理：用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55消化處理2h后，962min以滅活蛋白酶K.PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增。有的基因擴(kuò)增儀帶有專門(mén)用于原位PCR的裝置。雜交：PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交。顯微鏡觀察結(jié)果，另外還有膜結(jié)合PCR、錨定PCR、固著PCR、原位PCR、不對(duì)稱PCR、長(zhǎng)距離PCR、降落傘PCR、梯度PCR等30幾種PCR。（二）PCR在動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域中的運(yùn)用1、PCR在動(dòng)物產(chǎn)品檢測(cè)

10、領(lǐng)域的運(yùn)用隨著人們生活水平的提高，人們開(kāi)始越來(lái)越關(guān)注飲食的健康與安全。近年來(lái)，我國(guó)的畜牧業(yè)發(fā)展迅速，動(dòng)物產(chǎn)品的產(chǎn)量連年增長(zhǎng)。但發(fā)展過(guò)程中也出現(xiàn)了不少的問(wèn)題，動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量安全問(wèn)題就尤為突出，學(xué)有效的檢測(cè)手段成了我們保障飲食健康的一道關(guān)卡。PCR技術(shù)不斷取得突破，現(xiàn)已成為檢測(cè)食品衛(wèi)生安全的有效手段。唐吉思【9】定量PCR運(yùn)用于牛乳中金黃色葡萄球菌（S.aureus)的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)S.aureus SEA基因片段設(shè)計(jì)一對(duì)引物，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，建立S.aureus SEA DNA的SYBR Green I real-timePCR的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法具有較好的特異性和敏感性

11、，能夠快速檢測(cè)牛乳中的金黃色葡萄球菌。劉勝貴【1】PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中沙門(mén)氏菌，對(duì)已知和未知被沙門(mén)氏菌污染的豬肉的培養(yǎng)物均能準(zhǔn)確檢測(cè)。對(duì)不同稀釋度的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，當(dāng)DNA含量只有0.01pg時(shí)，還能擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明該方法檢測(cè)豬肉中沙門(mén)氏菌具有特異性高且靈敏、快速等特點(diǎn)。李敏【2】表明，將免疫磁珠技術(shù)（IMS)與多重PCR結(jié)合，24h內(nèi)即可檢測(cè)出食品中的單增李斯特菌，最低檢測(cè)限可達(dá)1cfu/25g(mL)。李苗云【3】冷卻豬肉貯藏過(guò)程中微生物的變化，直接提取不同冷藏天數(shù)肉樣DNA，對(duì)細(xì)菌16SrDNA的v6-v8區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)DGGE及序列分析，結(jié)果表明，冷卻豬肉好氧貯藏過(guò)程中的

12、主要微生物有：熱殺索絲菌、莫拉式菌、氣單胞菌、假單胞菌、葡萄球菌和節(jié)桿菌，快速檢測(cè)冷卻豬肉中微生物污染提供了新手段。2、PCR在動(dòng)物疫病防治領(lǐng)域的運(yùn)用 PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）是利用DNA聚合酶在體外大量擴(kuò)增兩段已知序列之間的某一特定DNA片段(又稱模板)的分子生物學(xué)技術(shù)。這種技術(shù)可以利用幾乎所有的臨床樣品探查病原體基因的存在和變異，從而對(duì)生物體的狀態(tài)和疫病作出診斷。因而,如何從被檢臨床樣品中高效、簡(jiǎn)便地提取核酸作為模板，就成為普及、推廣PCR技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物疫病亟待解決的問(wèn)題。 近年來(lái)，熒光定量PCR在病原體檢測(cè)方面得到了廣泛的運(yùn)用。羅寶正【6】等將TaqMan探針熒光PCR運(yùn)用到豬副嗜血桿菌的檢

13、測(cè)并使HPS和大腸桿菌0517、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌分開(kāi)，藺文成【11】等利用TaqMan探針熒光RT-PCR方法對(duì)豬細(xì)小病毒（ppv）感染的ST細(xì)胞48小時(shí)后JAK-1、JAK-2、STAT-1和STAT-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)JAK-1和JAK-2轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，STAT-1和STAT-2轉(zhuǎn)錄水平顯現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)證實(shí)該方法適用于豬細(xì)胞傳導(dǎo)因子JAK和STAT的定量檢測(cè)，許紅麗【10】等運(yùn)用熒光定量RT-PCR對(duì)犬瘟熱病毒PS株感染犬血清和糞便中病毒的檢測(cè)，檢測(cè)中，根據(jù)犬瘟熱病毒（CDV）核衣殼蛋白（NP）基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，擴(kuò)增NP基因，并以NP基因重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性

14、標(biāo)準(zhǔn)品，建立CDV的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：較常規(guī)RT-PCR該方法敏感性提高100倍，可以用于CDV病毒的致病機(jī)理及病毒傳播途徑的研究提供快速而敏感的檢測(cè)。楊少華【12】等建立了禽流感病毒RT-PCRELISA診斷方法，通過(guò)對(duì)A型禽流感（AI）保守的M基因設(shè)計(jì)引物，并分別用地高辛和生物素標(biāo)記，建立檢測(cè)A型AIV的 RT-PCRELISA方法，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最適反應(yīng)條件，使得該方法的敏感性比常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法高100倍以上且特異性強(qiáng)，克服了樣品含量少的困難，為早禽流感診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了一條新途徑。3、PCR在飼料開(kāi)發(fā)與

15、分析領(lǐng)域的運(yùn)用在動(dòng)物生產(chǎn)的過(guò)程中飼料的營(yíng)養(yǎng)均衡至關(guān)重要，傳統(tǒng)的谷物飼料一般難以滿足動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的需要，因此需要在飼料中動(dòng)物源性飼料，以滿足動(dòng)物生產(chǎn)對(duì)蛋白質(zhì)的需求。近年來(lái)，由于各種疫病的流行和新的危害性極大的傳染病的出現(xiàn)，動(dòng)物源性飼料的安全性難以保證。而PCR技術(shù)則為飼料中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)提供了有效地手段。于鳳芹【4】等將實(shí)時(shí)熒光PCR法運(yùn)用到檢測(cè)飼料中雞源性成分，根據(jù)雞線粒體DNA 建立Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)飼料中雞源性成分方法，并證實(shí)該方法特異性高，極具實(shí)用價(jià)值。4、PCR在動(dòng)物遺傳育種、基因表達(dá)、早期胚胎鑒定領(lǐng)域的運(yùn)用隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，研究動(dòng)物遺傳提供了理論依據(jù)和強(qiáng)大

16、的技術(shù)支持。其中PCR技術(shù)也被廣泛運(yùn)用于動(dòng)物遺傳領(lǐng)域的研究。趙秀華【5】R-SSCP方法檢測(cè)京海黃雞、AA雞、尤溪麻雞、邊雞4個(gè)雞品種STAT5b基因5調(diào)控區(qū)部分序列的多態(tài)性，并分析其對(duì)京海黃雞生長(zhǎng)繁殖性狀的遺傳效應(yīng)發(fā)現(xiàn)京海黃雞STAT5b基因5控區(qū)部分序列的多態(tài)性對(duì)其生長(zhǎng)和繁殖性狀有一定影響。張跟喜【7】PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)邊雞生長(zhǎng)抑制素（MSTN)基因外顯子的3的單核苷酸多態(tài)性，并與邊雞的繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了MSTN基因可能是影響邊雞繁殖性狀的一個(gè)主效基因或是與之存在緊密遺傳連鎖的一個(gè)標(biāo)記。王學(xué)清【8】CR技術(shù)運(yùn)用于牛早期胚胎性別的鑒定，在鑒定試驗(yàn)中裴翠娟等根據(jù)GenBank中收

17、錄的牛Y染色體特異序列和?；蚪M序列分別設(shè)計(jì)公牛特異引物和內(nèi)標(biāo)引物，通過(guò)對(duì)引物濃度的組合、dNTP濃度、Mg2+濃度、退火溫度的篩選優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增牛基因組DNA和胚胎基因組DNA，建立用于牛早期胚胎性別鑒定的多重PCR反應(yīng)體系，該方法能實(shí)現(xiàn)奶牛良種的快速擴(kuò)繁。綜上所述，PCR技術(shù)日新月異的發(fā)展極大地推動(dòng)了動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域的研究，為動(dòng)物科學(xué)分子領(lǐng)域的提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。在未來(lái)，隨著PCR技術(shù)創(chuàng)新，還將運(yùn)用在動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域其他方面，做出新的貢獻(xiàn)。做為動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域的研究者，我們應(yīng)該重視PCR技術(shù)運(yùn)用與創(chuàng)新，讓這門(mén)技術(shù)能夠更好地服務(wù)于社會(huì)。參考文獻(xiàn)：【1】劉勝貴，魏麟.應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中沙

18、門(mén)氏菌的研究J.科學(xué)食品，2007,28（3）：254-256.【2】 李敏，孟謹(jǐn)，鄭小平,等.IMS-PCR對(duì)食品中單增李斯特菌快速檢測(cè)J.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù).2010(3):1030-1032【3】 李苗云，周光宏，徐幸蓮.運(yùn)用PCR-DGGE研究冷卻豬肉貯藏過(guò)程種的優(yōu)勢(shì)菌J.西北農(nóng)業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,36（9）：185-189【4】 于鳳芹，王金玲，龐杰，王芳，姜麗，張瑩.實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)飼料中雞源性成分.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009,05【5】 趙秀華，王金玉，等.STAT5b基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)與京海黃雞生長(zhǎng)和繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析.中國(guó)畜牧雜志，2012,48（1）：1-4【6】 羅寶正，王振全，等.TaqMan探針熒光PCR檢測(cè)副豬嗜血桿菌方法的建立和應(yīng)用J.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（6）：1367-1370【7】 張跟喜，趙秀華，等.肌肉生長(zhǎng)抑制素基因外顯子3的多態(tài)性及其與邊雞繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析.中國(guó)畜牧雜志，2012,48（1）：9-11【8】 王學(xué)清，裴翠娟，等.鑒別牛早期胚胎的多重PCR技術(shù)研究.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011,26（6）：89-93【9】 唐吉思，吳金花，等.熒光定量PCR檢測(cè)牛乳中金