QPCR常見問題

1、QPCR中常見的問題Q:ROX1什么，有什么作用A:ROX1一種熒光染料，作為參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX這樣由于反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映PCR!程。ROXK正能夠極大地改進定量的精確度，提高重復管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。Q:熒光通道的選擇A:定量PCR實驗必須使用ROXK正熒光，占去一種熒光。TaqManlf針的淬滅基團（TAMRA也要占用一種熒光，對于4色檢測的儀器來說，只剩下2種熒光可以標記探針，對于5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqManMG深針，由于它的淬

2、滅基團是不發(fā)熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標記探針。如果實驗要求不高，不做ROXR正（AB公司不推薦這樣做），還可以再多一種熒光用于標記探針。研究應用本身的要求。如果研究SN可口基因突變，因為絕大多數(shù)人類基因是2態(tài)的，只存在兩種等位基因，2條探針已經(jīng)足夠。如果研究基因表達，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個內(nèi)對照，3色也就足夠了。Q:內(nèi)標法和外標法哪種數(shù)據(jù)更精密A:是同樣可靠的。內(nèi)標的優(yōu)點在于目標基因與管家基因的反應條件最接近一致，缺點在于目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發(fā)生競爭與抑制，導致它們的PCRt率有差異。外標的優(yōu)點在于目標基因與管家

3、基因的引物和探針之間沒有發(fā)生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它們的PCRt率有差異。兩相比較，內(nèi)標法與外標法的數(shù)據(jù)精確度是一樣的。熒光定量PCR、可題疑難解答Q1.這兩天我做標準曲線，線性關系還行，R2=o但是擴增效率只有80%另外擴增曲線也不光滑。2.我用SYBR乍為熒光染料，樣品的熒光強度也挺低的只有100-200左右。A:曲線不光滑有時跟染料的量相關，可以加大；或者是擴增產(chǎn)物太少了。擴增效率差有引物、試劑和PC徐件的原因?？梢宰鰷囟忍荻让鲗嶒?，尋找最佳退火溫度（擴增子的影響）；還可以增加Mg離子的濃度；如果其他條件都好了，還不行，那就是引物的原因。樣

4、品稀釋準確很重要，做標準曲線不好的很多原因是倍比稀釋的問題，正常情況10倍比稀釋時前后是相差個循環(huán)。Q:熒光定量PCR勺靈敏度A:對于染料法的熒光定量來說，Cq值在1330之間比較準確，3033之間需要再次確認，在以上范圍內(nèi)的置信度比較差。Q:標準曲線要重復兩三次嗎A:不是，只是用來做標準曲線的梯度點最好不要少于4個，否則標準曲線準確性不高。Q:關于熒光定量標準曲線的制作A:一般的儀器雖然聲稱能進行單拷貝檢測，但如果不是特別設計的體系很難做到100拷貝以下的準確定量。一般用來做標準曲線的最小濃度為1000拷貝，再往下可靠性就降低了。這不是稀釋或其他什么問題，而是本身你選作標準曲線的濃度以及定量

5、濃度最好不要低于1000拷貝，100拷貝也勉強可以接受。否則即使做出來，認可度也不會太高。Q：熔解曲線高矮是什么意思A:Tm值相同，而峰高低有差異是表達豐度不同。同樣的擴增產(chǎn)物也會出現(xiàn)Tm值有微小差異，一般差異在1度以內(nèi)都可以接受。熔解曲線的縱坐標表示熒光信號對溫度的一階負導數(shù)。Q:定量PCRS有擴增？A:把定量PCR勺產(chǎn)物跑個電泳看有無產(chǎn)物，如果電泳有條帶說明PC雙成功的，只是熒光信號沒有讀取到，這時要調(diào)整染料或探針的濃度。如果電泳沒有條帶，那么還要在定量PCF上優(yōu)化實驗條件。雖然你在普通PCRK上優(yōu)化過條件，但換了定量pcf<,由于兩臺儀器的升降溫速度及溫度精密度等指標存在差異同樣的

6、條件做不出PCRi是可能的。Q：熒光定量real-timePCR重復性問題A：建議不要只加1ul,而是稀釋10倍左右然后加10ul這樣有助于改善重復性。如果你測的是拷貝數(shù)重復性不好是很難避免的。我感覺用SYBRgreen作realtime的誤差還是比較大的，它的優(yōu)勢在于靈敏度高但如果想精確定量還是比較困難的。探針法特異性最好。Q：擴增時忘了做熔解曲線了，現(xiàn)在是不是沒法再做融解曲線了A:把定量PCFT物重新作熔解曲線，只是新建立一個反應，反應條件按照熔解曲線的條件設定就可以了沒必要重新作定量Q:熒光閾值高怎么改進A：閾值取決于基線，基線是313cycles左右的熒光信號值標準偏差10倍?？赡苁潜?/p>

7、景高，把模板純化一下。就可能是模板濃度較高，起峰早導致的閾值線過Mi。Q：熒光定量PCR僉測靈敏度和線性范圍的關系A:一般大家認為的檢測靈敏度即檢測下限，可以理解為能檢測到和準確定量的最低濃度（拷貝數(shù)）。而線性范圍為能夠檢測的區(qū)間，即可以檢測及分辨的最低濃度到最高濃度的數(shù)量級。但兩者都與熒光定量PCR儀器及試劑體系相關。Q:realtimePCRCq值一般在多少后認為模板沒擴增A：當進入對數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35個時，RealTimeRT-PCR僉測無效基因沒有表達。當進入對數(shù)的循環(huán)數(shù)在32-35個循環(huán)時，需要有至少3個重復才能判斷是否能檢測到基因的表達。Q:正常情況NTC是不應Ig出現(xiàn)Cq值的嗎

8、A如果是探針法，應該沒有Cq值。如果是染料法，可能在30個循環(huán)后有微弱起峰，并且軟件計算出Cq值。這時還要觀察熔解曲線，看擴增產(chǎn)物是否是引物二聚體。如果溶解曲線的Tm值在80度以下那么很可能是引物二聚體，這時也可以優(yōu)化條件比如提高退火溫度等。如果溶解曲線是雙峰或更多峰，其中有與加模板后的擴增產(chǎn)物的Tm值相同的峰那么就意味著存在污染。如果是探針法陰性對照起峰肯定是污染。Q:realtimePCR無結果，而用產(chǎn)物跑電泳條帶很清楚，什么問題A：因為加樣的時間太長了，熒光染料暴露時間太長熒光基團淬滅了；出現(xiàn)上述問題還有一種情況,就是熒光PCF的熒光采取信號值太低。如果使用探針法有熒光信號而沒有求出Cq

9、值，可能探針濃度有問題。Q:最佳熒光采集溫度A:采集熒光的時機不是取決于溫度而是取決于采用的方法。染料法*一般要在延伸階段的末點進行檢測，而72度延伸的效率最高所以采用染料法時大多在72度檢測。如果擴增產(chǎn)物中存在引物二聚體，也有采用更高的讀板溫度比如76度、80度等。TaqMan探針法*由于TaqMan探針是累積熒光，理論上說在任何步驟檢測都可以但目前TaqMan大多采用兩步法，所以在退火的末點進行檢測即可。分子信標法*就要在退火的末點進行檢測。FRET®車+法*要在退火時進行熒光檢測。Q:定量PCR中質(zhì)粒作為標準分子為何要線性化A:因為要檢測的目的基因應該是線性的。而目的基因確是連

10、接在環(huán)狀的質(zhì)粒上的。所以首先需要質(zhì)粒線性化并保證完全酶切，然后要回收。注意線性化的質(zhì)粒不容易保存。所以如果有實驗證據(jù)證明不線性化的質(zhì)?？梢杂媚蔷涂梢允∪ズ芏嗍虑榱?。Fig.6alsoshowstheefficiencyofthePCRreactionisnotalteredbyusingcircularplasmidDNAinplaceoflinearisedplasmidDNA.線形化與環(huán)狀質(zhì)粒比較文章。這篇文章用這個質(zhì)粒對線性化和非線性化做了比較，從實驗結果看線性化并沒有對標準曲線產(chǎn)生任何改變。但是這篇文章只是擺出了試驗結果并沒有從原理上分析這個實驗結果的原因。因此線性化對于標準曲線的作用

11、并不能以這篇文章的結果來外推。就是說可能需要更多的實驗結果。或者從原理上分析了這篇文章的結果才能得出結論來說明。Q:realtimepcr不同基因之間的閾值(threshold)是不是要一樣啊A:如果做標準曲線或者相對定量建議閾值還是一樣比較好。而且閾值一般要放置于擴增曲線的指數(shù)段，即熒光數(shù)據(jù)對數(shù)坐標軸下的線性段。如果擴增曲線的效率接近，閾值線的位置對于定量結果的影響是微乎其微的。Q:擴增曲線本底不斷升高是什么原因A:1、試劑質(zhì)量差是主要原因；2、模板不純是一個重要原因；Q:只要Cq值大于30都是陰性嗎A:要與對照品比對才能定性分析。不過一般Cq值大于30結果置信度降低，需要多次確認。常規(guī)修飾

12、基團分子量5'-Biotin3'-TAMARA5'-(6FAM)3'-Dabsyl5'-HEX3'-(6FAM)5'-TET3'-AminoModifierC35'-Cy53'-AminoModifierC75'-Cy33'-ThiolModifierC3Q:待測基因的Cq值大多在1825之間，但內(nèi)參的Cq值很低。第一次做時基本都在10左右，將模板稀釋10倍后第二次的內(nèi)參照的Cq值還是在1214之間。以這樣的數(shù)據(jù)分析會影響結果的準確度嗎A:每次都做陰性對照并且陰性對照Cq為0,那Cq30就肯定不是污染，而是基因表達量低或是模板太稀。內(nèi)參Cq為1014都正常，沒必要再稀釋模板了。不過內(nèi)參Cq低于10,結果可能會有偏差。Q:請問下現(xiàn)在的PCR熒光診斷試劑盒里面，國家規(guī)定都要求要有臨界陽對照嗎這些對照品是不是一定要和樣本一起提取呢還有臨界陽用陽性對照來稀釋來得到可以嗎A:陽性對照和陰性對照必須要和樣品一起提取，進行平行實驗，這樣才有作為對照的意義。臨界陽性樣品是不能通過陽性對照稀釋的，除非你知道臨界陽性的濃度，經(jīng)過定量標定將陽性對照稀釋到臨界陽性。Qt.realtimePCR結果熔解曲線中出