利什曼原蟲(chóng)減毒活疫苗研究進(jìn)展.docx

1、doi：10.3969/j.issn.1005-3697.2015.05.04:感染與免疫疾病研究專題-綜述*利什曼原蟲(chóng)減毒活疫苗研究進(jìn)展劉鵬，技保遷(川北醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與分子生物學(xué)研究所，四川南充637000)【摘要】利什曼原蟲(chóng)減毒活疫苗因其保留大部分免疫原性,能感染巨噬細(xì)胞，誘發(fā)與自然感染類似的免疫應(yīng)答而受到眾多科學(xué)家的青睞。本文綜述了近年來(lái)減毒活疫苗的研究進(jìn)展C【關(guān)鍵詞】利什曼病；基因減毒活疫苗；理化減毒(文章編號(hào)】1005-3697(2015)05X)59025【中圖分類號(hào)】R382.2'2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】AAdvancesintheresearchofLeishmanialive

2、attenuatedvaccineLIUPeng,JlNGBao-qian(InstituteofImmunologyandMolecularBiology,NorthSichuanMedicalcollege,Nanchong637000,SichuanfChina)AbstractLeishmanialiveattenuatedvaccinesremainthemostofparasiticimmunogenecityandcanenterintothemacrophagethatissimilartonaturalinfection,whichhaveinterestedmanyrese

3、archers.Thispaperreviewsthestudyofthenewestattenuatedstrains.KeywordsLeishmaniasis；Geneticliveattenuatedvaccine；Physicochemicalattenuation基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(30872213)收瑁日期：2015-07-20作者簡(jiǎn)介：劉刷(1990-).男，四川南充人，碩士研究生，主斐從事杜氏利什曼原蟲(chóng)免疫蛋白組學(xué)研究“通訊作者:敬保遷,E-mail：bqjing網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-10-26)7：14網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：/利什曼原蟲(chóng)包含26個(gè)種株，所致利什曼

4、病在全球98個(gè)國(guó)家傳播。傳統(tǒng)藥物治療存在費(fèi)用昂貴、毒副作用、藥物耐受等問(wèn)題，疫苗仍是未來(lái)控制利什曼病的主要手段。在抗利什曼病疫苗研制過(guò)程中，死疫苗雖然安全性高，但對(duì)人免疫原性低，已宣告失敗“；通過(guò)皮下接種體外培養(yǎng)的活蟲(chóng)(leishmaniza-tion)也因接種處皮膚常發(fā)展成難治性皮損而被叫停；目前雖有三個(gè)重組亞單位疫苗得到應(yīng)用許可，但僅限于犬利什曼病的免疫治療或預(yù)防，少數(shù)重組疫苗雖進(jìn)入人體1期臨床試驗(yàn)，并表現(xiàn)出免疫原性，但其對(duì)人群保護(hù)率仍需進(jìn)一步評(píng)價(jià)；DNA疫苗因難以刺激產(chǎn)生有效的抗利什曼病免疫力，發(fā)展前景堪憂J。近年來(lái)通過(guò)基因敲除、基因過(guò)表達(dá)及其它理化方法等進(jìn)行減毒的利什曼原蟲(chóng)活疫苗，由于

5、它們?cè)隗w內(nèi)的活動(dòng)與自然感染相似，有良好的免疫保護(hù)潛能，總體上安全，預(yù)示發(fā)展前景較好。現(xiàn)綜述如Fo1基因減毒疫苗1-1碩大利什曼原蟲(chóng)脂磷酸多糖基因敲除株利什夏原蟲(chóng)表面的脂磷酸多糖(lipophosphogly-can,LGP)與磷酸多糖(phosphoglycan,PG)為原蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞成份,LGP1、LCP2及LGP3基因的編碼蛋白分別參與其合成。Uzonna等以敲除L(；P2基因的碩大利什曼原蟲(chóng)感染BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期維持低量蟲(chóng)荷數(shù)，并可抵抗碩大利什曼原蟲(chóng)野生株的攻擊感染7_8；o而Spath等以該減毒0感染8只BALB/c小鼠，有3只在免疫125d后出現(xiàn)進(jìn)行性皮損，可見(jiàn)該減

6、毒株存在長(zhǎng)期毒性。并且,Thomas等發(fā)現(xiàn)敲除ZGP1基因的墨西哥利什曼原蟲(chóng)并未被減毒，進(jìn)一步說(shuō)明通過(guò)敲除利什曼原蟲(chóng)LGP基因發(fā)展減毒活疫苗的安全性存疑，其主要原因可能與不同種株原蟲(chóng)間LGP的表達(dá)存在差異有關(guān)"七1.2墨西哥利什曼原蟲(chóng)半胱氨酸墨白酶基因敲除株利什曼原蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶(cysteineproteinase,CP)包括CPA.CPB及CPC,參與原蟲(chóng)自噬體形成及前鞭毛體向無(wú)鞭毛體的轉(zhuǎn)化'。Alexander等以墨西哥利什曼原蟲(chóng)CPA與CPB基因敲除株感染BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)CPA-株可致病，而CPB-或CPA-/CPB-株對(duì)BALB/c小鼠弱致病或不致病，與墨西

7、哥利什曼原蟲(chóng)野生株感染相比，減毒株感染小鼠的免疫類型從Th2型轉(zhuǎn)化成Thl型，并能抵抗墨西哥利什曼原蟲(chóng)野生株的攻擊感染。Saravia等:以墨西哥利什曼原蟲(chóng)CPB或CPA/CPB株感染金黃地鼠后，疾病發(fā)生延遲，而且病損減輕，蟲(chóng)荷下降；感染人巨噬細(xì)胞，原蟲(chóng)保持前鞭毛體狀態(tài)，生長(zhǎng)緩慢。并且，墨西哥利什曼原蟲(chóng)CPA/CPB株免疫金黃地鼠后，其Th2型相關(guān)細(xì)胞因于IL.10、TGF-。表達(dá)水平顯著下降，對(duì)墨西哥利什曼原蟲(chóng)野生株攻擊感染的免疫保護(hù)率可達(dá)63.6%。說(shuō)明利什曼原蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶基因敲除株對(duì)小鼠、金黃地鼠及人的致病力顯著減弱，具有減毒活疫苗發(fā)展前景。1.3嬰兒利什JS原蟲(chóng)熱休克蛋白70-11

8、基因敲除株熱休克蛋白70(hotshockprotein70.HSP70)在原蟲(chóng)無(wú)鞭毛體期表達(dá)，阻止無(wú)鞭毛體內(nèi)蛋白的錯(cuò)誤折疊并參與受損蛋白的降解°Folgueira等山】敲除嬰兒利什曼原蟲(chóng)的HSP70-II基因后，原蟲(chóng)形態(tài)轉(zhuǎn)變成橢圓形、雙糧毛的畸形蟲(chóng)體。與野生株相比，其感染巨噬細(xì)胞能力不變但生存能力降低。以10嬰兒利什曼原蟲(chóng)HSF70-II株感染BALB/c小鼠,4周后，肝臟蟲(chóng)荷數(shù)較野生株降低1000倍，脾臟未見(jiàn)原蟲(chóng)。Carrion等'以107嬰兒利什曼原蟲(chóng)HSP70-II株免疫5只BALB/c小鼠,4周后以碩大利什曼原蟲(chóng)攻擊感染，除1只小鼠在感染后第七天出現(xiàn)約0.25mn?

9、的皮損外，其它無(wú)皮損，而單純感染碩大利什曼原蟲(chóng)的對(duì)照組平均皮損面積約2.53.0mm：可見(jiàn)該株能產(chǎn)生抗野生型碩大利什曼原蟲(chóng)的交叉免疫保護(hù)。1.4杜氏利什曼原蟲(chóng)p27蛋白基因減毒株p27是線粒體內(nèi)膜單跨膜蛋白，細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合酶的組成部份，在氧化呼吸鏈中通過(guò)傳遞H,而合成ATP。由于p27是利什曼原蟲(chóng)無(wú)鞭毛體期特異表達(dá)蛋白，原蟲(chóng)通過(guò)其增加ATP合成，通過(guò)質(zhì)子泵交換來(lái)抵抗巨噬細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境"用。Dey等頃以杜氏利什曼原蟲(chóng)p27./株感染BALB/c小鼠，13周后，肝臟中蟲(chóng)荷約為對(duì)照組的1.25%，脾臟無(wú)原蟲(chóng)，16周后肝脾均無(wú)原蟲(chóng)，說(shuō)明其毒力明顯降低。以Ldp27A株免疫BALB/c小

10、鼠后，用野生型杜氏利什曼原蟲(chóng)攻擊感染，與對(duì)照組比較，12周后實(shí)驗(yàn)組肝脾內(nèi)蟲(chóng)荷數(shù)分別降低了300104倍。20周后實(shí)驗(yàn)組肝脾內(nèi)無(wú)原蟲(chóng):。并且，實(shí)驗(yàn)組Thl型CD"及CD8'T細(xì)胞數(shù)最高于對(duì)照組，將上述實(shí)驗(yàn)組小鼠T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給未經(jīng)免疫的小鼠，后者亦對(duì)利什曼原蟲(chóng)感染產(chǎn)生免疫保護(hù)。Ldp27"株免疫后以碩大利什曼原蟲(chóng)、巴西利什曼原蟲(chóng)攻擊感染，亦存在交叉免疫保護(hù))。1.5杜氏利什曼原蟲(chóng)類泛素折疊修飾蛋白1基因缺陷株與杜氏利什曼原蟲(chóng)特異性泛素折整修飾蛋白1蛋白酶基因缺陷株線粒體三功能蛋白(mitochondrialtri-functionalprotein,MTP)是脂肪酸中

11、氧化加水、脫氫、硫解的關(guān)鍵酶，杜氏利什曼原蟲(chóng)類泛素折疊修飾蛋白1(Ubiquitinfoldmodifierl,Ufml)活化后與MTP的a-亞基共價(jià)結(jié)合而調(diào)節(jié)線粒體脂肪酸代謝。Ufml或特異性Ufml蛋白酶(Ufml-specificprotease,Ufsp)缺陷后MTP活性降低，乙酰輔酶A(acetyl-CoA)合成減少，原蟲(chóng)生存能力降低”刁OGannavaram等完全敲除杜氏利什曼原蟲(chóng)Ufml基因，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)LdUfmr株3d后即停止增殖，乙酰輔酶A合成量低于0.5pmol/jiL,對(duì)照組高于2.5pmol/p,LoLdUfml'巨噬細(xì)胞感染率與對(duì)照組一致，但隨后原蟲(chóng)數(shù)量逐漸

12、降低，至第7天已無(wú)原蟲(chóng)。電鏡下核分裂障礙，線粒體形態(tài)改變。將杜氏利什曼原蟲(chóng)Ufsp基因完全敲除后，亦喪失與MTP結(jié)合的能力，原蟲(chóng)在體外培養(yǎng)第5天后停止增殖，感染巨噬細(xì)胞能力下降，感染BALB/c小鼠,4周后肝脾蟲(chóng)荷數(shù)比野生蟲(chóng)株對(duì)照組分別下降100倍、20倍3)。說(shuō)明剔除與脂肪酸代謝相關(guān)基因的利什曼原蟲(chóng)具有發(fā)展減毒活疫苗的前景。1.6嬰兒利什曼原蟲(chóng)細(xì)胞胞漿內(nèi)沉默信息調(diào)節(jié)子2單等位基因缺陷株細(xì)胞胞漿內(nèi)沉默信息調(diào)節(jié)子2(silentinformationregulatory2,SIR2)具有NAD依耐的組氨酸去乙酰化酶活性，在基因轉(zhuǎn)錄沉默和DNA修復(fù)中發(fā)揮作用m】。Vergnes等'明發(fā)現(xiàn)將

13、嬰兒利什曼原蟲(chóng)SIR2雙等位基因完全敲除后則形成致死性敲除，而將原蟲(chóng)SIR2單等位基因敲除后，則不影響前鞭毛體的生長(zhǎng)，但無(wú)鞭毛體在體外巨噬細(xì)胞內(nèi)和Balb/c小鼠體內(nèi)增殖能力顯著下降,BALB/c小鼠感染嬰兒利什曼原蟲(chóng)LiSIR2.八株，8周后肝脾已無(wú)蟲(chóng)荷。說(shuō)明S/R2基因是影響無(wú)糧毛體增殖和生存相關(guān)基因。Silvestre等以嬰兒利什曼原蟲(chóng)LiSIR2"株免疫4只BALB/c小鼠后，用野生型嬰兒利什曼原蟲(chóng)攻擊感染10周后，全部小鼠肝脾均無(wú)原蟲(chóng)，對(duì)照組小鼠單純接受嬰兒利什曼原蟲(chóng)感染，其肝脾蟲(chóng)荷分別高達(dá)io5J0612710說(shuō)明嬰兒利什曼原蟲(chóng)LiSIR2株具有發(fā)展抗內(nèi)臟利什曼病減毒活疫

14、苗的潛力。1.7巴西利什曼原蟲(chóng)小外顯子基因過(guò)表達(dá)減毒株-反式剪接是錐蟲(chóng)科原蟲(chóng)基因表達(dá)調(diào)控的重要方式，其中，小夕卜顯子基因（miniexongene）通過(guò)對(duì)動(dòng)基體多順?lè)醋忧癿RNA添加5未端，為每個(gè)mRNA分子提供5,冒狀結(jié)構(gòu)促進(jìn)其成熟。先前Antoniazi等）通過(guò)基因重組方式在碩大利什曼原蟲(chóng)內(nèi)過(guò)量表達(dá)小外顯子基因；發(fā)現(xiàn)原蟲(chóng)對(duì)Balb/c小鼠的毒力減低;deToledo等將含100個(gè)拷貝的小外顯子基因重組至巴西利什曼原蟲(chóng)，原蟲(chóng)能正常生長(zhǎng)但對(duì)BALB/c小鼠及金黃地鼠致病力降低。BALB/c小鼠耳部皮下接種IO,該減毒株，在28周間耳與淋巴結(jié)均無(wú)蟲(chóng)荷；10只金黃地鼠皮下接種10,該減毒株后，除兩

15、只金黃地鼠出現(xiàn)較小皮損外，其它地鼠無(wú)皮損。Northern雜交證實(shí)上述出現(xiàn)皮損的兩只地鼠體內(nèi)的原蟲(chóng)不再過(guò)量表達(dá)小外顯子基因3：。故該減毒株雖減毒有效，但有恢復(fù)毒力的風(fēng)險(xiǎn)。1-8.杜氏利什J!原蟲(chóng)中心體蛋白基因缺失株利什曼原蟲(chóng)中心體蛋白（centrinprotein,CP）為調(diào)節(jié)中心體復(fù)制與分裂的鈣結(jié)合細(xì)胞骨架蛋白，與原蟲(chóng)生長(zhǎng)密切相關(guān)Selvapandiyan等以3xIO。杜氏利什曼原蟲(chóng)LdCP'株感染BALB/c小鼠，12周后肝脾無(wú)原蟲(chóng)，而野生型杜氏利什曼原蟲(chóng)的對(duì)照組蟲(chóng)荷數(shù)達(dá)10IO。經(jīng)杜氏利什曼原蟲(chóng)Ld-CP"株免疫接種后的BALB/c小鼠，以3X106野生型杜氏利什曼原蟲(chóng)

16、攻擊感染，12周或16周后肝臟無(wú)原蟲(chóng)，脾臟蟲(chóng)荷數(shù)較對(duì)照組降低了一半。而以杜氏利什曼原蟲(chóng)LdCP"-株免疫犬后，可刺激犬產(chǎn)生高水平的IgGl和lgG2,B水平的淋巴細(xì)胞刺激反應(yīng),IFN-7、TNF-a、IL-12分泌增加，IL4分泌下降以嬰兒利什曼原蟲(chóng)對(duì)免疫接種后的實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行攻擊感染，18個(gè)月后蟲(chóng)荷數(shù)下降達(dá)83.7%）。說(shuō)明杜氏利什曼原蟲(chóng)LdCP"株也具有發(fā)展抗內(nèi)臟利什曼病減毒活疫苗的潛力。2物理、化學(xué)處理減毒2.1杜氏利什原蟲(chóng)7射線減毒株Datla等M以150Gy吸收劑量的y射線處理杜氏利什曼原蟲(chóng)，原蟲(chóng)5d后停止生長(zhǎng)，以該減毒株免疫小鼠后，用2x106野生型杜氏利什曼原蟲(chóng)攻

17、擊感染，120d后小鼠肝、脾重量較對(duì)照組減輕了33%；3?%,蟲(chóng)荷數(shù)降低了87%、88%,IFN-7、IL-2與TNF-a比對(duì)照組分別上升了4倍、2.6倍、3.9倍；而IL4與IL-10分別是對(duì)照組的68%.50%o說(shuō)明該減毒株能刺激小鼠產(chǎn)生以Thl型反應(yīng)為主的免疫保護(hù)力。并且，以該減毒株兩次肌肉注射（間隔時(shí)間15d）治療小鼠內(nèi)臟利什曼病，治療后NO與超氧化物量增加了兩倍，脾臟蟲(chóng)荷數(shù)較病鼠降低約80%【坨?？梢?jiàn)）射線減毒的杜氏利什曼原蟲(chóng)能夠預(yù)防和治療小鼠內(nèi)臟利什曼病。2.2嬰兒利什曼原蟲(chóng)雖死猶活株Brockstedt等最初發(fā)現(xiàn)李斯特氏菌在uvrAB等核酸修復(fù)酶基因表達(dá)缺失狀況下，以DNA交聯(lián)劑

18、補(bǔ)骨脂和長(zhǎng)波紫外線進(jìn)行光化學(xué)處理，細(xì)菌失去增殖能力，恒短時(shí)體內(nèi)代謝活性仍維持,稱為雖死猶活菌（Killedbutmetabolicallyactive,KBMA）o它可誘導(dǎo)CD4,和CD8T細(xì)胞應(yīng)答和保護(hù)小鼠免受病毒感染。Bruhn等1在含100nM補(bǔ)骨脂衍生物S-59的培養(yǎng)基中培養(yǎng)嬰兒利什曼原蟲(chóng)1h,以5.4J/cm2紫外光照射后得到嬰兒利什曼原蟲(chóng)KBMA株，其代謝。活性可維持21d,并能感染巨噬細(xì)胞。以該株10*接種小鼠,2周后CD4*T細(xì)胞、IL2、IL4、IL-5、IL-10JL-12量與野生株感染相似;6個(gè)月后實(shí)驗(yàn)組小鼠肝脾無(wú)原蟲(chóng)，大小正常；野生株對(duì)照組肝臟蟲(chóng)荷數(shù)2.6x107

19、77;0.6x107,脾中蟲(chóng)荷數(shù)2.0x107±0.5小10二懷脾明顯腫大。以10嬰兒利什曼原蟲(chóng)KBMA株皮下免疫小鼠3次后，以10,嬰兒利什曼原蟲(chóng)野生株感染小鼠，對(duì)照組以生理鹽水注射3次后接受原蟲(chóng)感染。2周和8周后實(shí)驗(yàn)組肝臟原蟲(chóng)分別約降低了0.4倍、0.6倍，說(shuō)明這類利什曼原蟲(chóng)全細(xì)胞疫苗安全可靠，雖其對(duì)小鼠免疫保護(hù)還不甚理想，但還是顯示出具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值，2.3利什曼原蟲(chóng)慶大霉素減毒株（H株）慶大霉素通過(guò)下調(diào)利什曼原蟲(chóng)依賴錐蟲(chóng)氧還蛋白過(guò)氧化物酶（tryparedoxindependentperoxidase,LiTryP）表達(dá)，導(dǎo)致原蟲(chóng)對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物清除障礙功。Danesh

20、var等頃】在含20p,g/mL慶大霉素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)墨西哥利什曼原蟲(chóng)、碩大利什曼原蟲(chóng)、嬰兒利什曼原蟲(chóng)、杜氏利什曼原蟲(chóng)至20、11、11、10代時(shí)得到減毒株（H株）前鞭毛體。墨西哥利什曼原蟲(chóng)H株對(duì)巨噬細(xì)胞感染率在感染后9-96h內(nèi)由53%減至0.4%,無(wú)鞭毛體的數(shù)量由98%降至2%0碩大利什曼原蟲(chóng)H株、嬰兒利什曼原蟲(chóng)H株、杜氏利什曼原蟲(chóng)H株亦出現(xiàn)下降趨勢(shì)。用5xl06墨西哥利什曼原蟲(chóng)H株或碩大利什曼原蟲(chóng)H株分別皮下感染5只BLAB/c小鼠，12周后墨西哥利什曼原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)組的4只小鼠無(wú)皮損，1只自限性輕微皮損；碩大利什曼原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)組5只小鼠均無(wú)皮損。而對(duì)照組的10只小鼠均出現(xiàn)逐漸擴(kuò)大的皮損。

21、將嬰兒利什曼原蟲(chóng)H株分別經(jīng)靜脈或皮下感染敏感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物犬，對(duì)照組經(jīng)靜脈或皮下接種野生型嬰兒利什曼原蟲(chóng)，在觀察期間,實(shí)驗(yàn)組均無(wú)臨床癥狀，12個(gè)月后解剖發(fā)現(xiàn)肝脾無(wú)病理變化，亦無(wú)蟲(chóng)荷，而對(duì)照組部分出現(xiàn)臨床癥狀，病犬肝脾均有病理改變以墨西哥利什曼原蟲(chóng)H株或碩大利什曼原蟲(chóng)H株免疫小鼠后分別用碩大利什曼原蟲(chóng)野生株和墨西哥利什曼原蟲(chóng)野生株攻擊感染，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)減毒株接種后對(duì)小鼠有顯著免疫保護(hù)作用"°：。以嬰兒利什曼原蟲(chóng)H株大規(guī)模免疫46只實(shí)驗(yàn)犬后，投放至流行區(qū)，僅一只出現(xiàn)臨床癥狀，PCR檢測(cè)陰性。而未經(jīng)嬰兒利什曼原蟲(chóng)H株免疫的31只實(shí)驗(yàn)犬，投放到流行區(qū)后，1只犬因CVL在19個(gè)月死亡，另9只犬

22、出現(xiàn)臨床癥狀，PCR檢測(cè)陽(yáng)性。說(shuō)明嬰兒利什曼原蟲(chóng)H株免疫實(shí)驗(yàn)犬可產(chǎn)生明顯保護(hù)免疫，保護(hù)率達(dá)97.8%"2】。3結(jié)語(yǔ)利什曼原蟲(chóng)專性細(xì)胞內(nèi)寄生，保護(hù)性免疫應(yīng)答以細(xì)胞免疫為主。無(wú)癥狀感染者與利什曼病痊愈者對(duì)再次感染可產(chǎn)生完全免疫保護(hù)，成功研制抗利什曼病疫苗的可能性較大。減毒活疫苗具有強(qiáng)烈刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答潛能，但通過(guò)理化等方法進(jìn)行減毒的利什曼原蟲(chóng)疫苗株具有毒力回復(fù)突變的潛在危險(xiǎn)，通過(guò)對(duì)毒力基因敲除等方法進(jìn)行減毒的利什曼原蟲(chóng)疫苗株，雖減毒穩(wěn)定，但由于毒力基因的表達(dá)存在種株差.異和生活史時(shí)期差異，敲除不同種株利什曼原蟲(chóng)同一毒力基因減毒效果迥異'。從在不同種株和生活史時(shí)期表達(dá)穩(wěn)定,且對(duì)原蟲(chóng)

23、生命影響較小的毒力基因中選擇靶基因研制抗利什曼病減毒活疫苗顯得尤為重,要。畚考文獻(xiàn)JoshuaM.Mutis。J,ChegeM,etal.DevelopmentofLcishmaniavaccines：predictingthefuturefrompastandpresentexperienceJ.JBiomedRes,2013,2(2)：85-102.2SassanN,FarrokhM,KhamesipourA,etal.Firstgenerationleish-maniasisvaccines:AreviewoffieldefficacytrialsJVaccine,2008,26(52)

24、：6759-6767.*31AlvarJ,CroftSL,KayeP,efal.Casestudyforavaccineagainstleishmaniasis'J.Vaccine,2013,31(Suppl2)：244-249Palatnik-de-souaaCB.Vaccinesforleishmaniasisintheforecoining25yearaJ.Vaccine,2008,26(14):1709-1724."5*ChakravartyJ,KumarS.TrivetliSAal.Clinicaltrialtoevaluatethesafetyandimmunog

25、enicityoftheLEISH-F1+MPL-SEvaccineforuseinthepreventionofvisceralleishmaniasis：JJ.Vaccine,2011,29(19)：3531-3537.6 PirdelL,HosseihiAZ.RasouliM.ImmuneresponseinsusceptibleBAI.B/cmiceimmunizedwithDNAencodingLipophosphoglycan3(LPG3)ofIxishmaniainfantumfJ'.ParasiteImmunol,2014,36(12)：700-707.7 Uzonna

26、JE,SpathGF,BeverleySMal.Vaccinationwithphos-phoglycan-deficientLeishmaniamajorprotectshighlysusceptiblemicefromvirulentchallengewithoutinducingastrongThlresponse；J.JImmunol,2004,172(6):3793-3797.8LiuD,Okwor1,MouZ,elal.DeficiencyofLeishmaniaPhospho-glycansInfluencestheMagnitudebutDocsNotAffecttheQual

27、ityofSecondary(Memory)Anti-Leii«hmaniaImmunityJ.PloSONE,2013,8(6)：c66058.9jSpathGF,LyeLF,SegawaH,etal.IdentiGcationofacompensatorymutant(Ipg2-REV)ofLeishmaniamajorabletosurviveasamastigoteswithinmacrophageswithoutLPG2-dependentglycoconjugatesanditssignificancetovirulenceandimmunizationstrategie

28、sJ.InfectImmun,2004,72(6)：3622-3627.'10ThomasI.LipophosphoglycanisnotrequiredforinfectionofmacrophagesormicebyLeishmaniamexicanafJ.TheEBMOJour*nal,2000,19(9)；1953-1962.11張仁制，張潔，敬保遷.不同種(株)利什曼原蟲(chóng)毒力相關(guān)基因的表達(dá)差異J'.中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志,2009,27(4)：307-31】.-12WilliamsR,TetleyL.MottramJC,etal.Cysteinepeptidase

29、sCPAandCPBarevitalforautophagyanddifferentiationinLeiithmaniamexicanaJ.MolMicrobiol,2006.61(3)：655-674.'13jAlexanderJ,CoombsGH,MottramJC.Lrishmaniamexicanacysteineproteinase-deGcientmutantshaveattenuatedvirulenceformiceandpotentiateaThlresponseJ.JImmunol,1998,161(12)：6794-801.14SaraviaNG.Escorci

30、aB,OsorioY,etal.Pathogenicityandprotectiveimmunogenicityofcysteineproteinase-deGcientmutantsof.lcishmaniamexicanainnon-murinemodelsJ.Vaccine,2006,24(19)：4247-4259.15MayerMP,BukauB.Hsp70chaperones：cellularfunctionsandmolecularmechanismJ.CellMolLifeSci,2005,62(6)：670一684.16FolgueiraC,CarrionJ,MorenoJ,

31、“al.EffectsofthedisruptionoftheHSP70-HgeneontheGrowth,morphologyandvirulenceofLeishmaniainfantumpromaMigotes"JIntMicrobiol.2008,11(2)：81-89.17CarrionJ,Folgueira.C.SotoMteral.LeifthmaniainfantumHSP70-IInullmutantascandidatevaccineagainstleishmaniasis:apreliminaryevaluation'J.ParaitVectors,20

32、11.4；150.18LimH,CheongHK,RhoJR,elal.Expression,purificationandcharacterizationofhumanvacuolar-typeH(+)-ATPa»esubunitdiand<12inEscherichiacoJiJ.ProteinExprPurif,2014,9(8):25-31.'19DeyR,MenesesC,SalotraPqal.CharactcriiationofaLcishma-niaStagespeciGcmitochondrialmembraneproteinthatenhancest

33、heactivityofcytochromecoxidaseanditsroleinvirulence_JJ.MolMicrobiol,2010,77(2)：399-414.20DeyR,DagurPK,SelvapandiyanA,etal.Liveattenuated"ish-maniadonovanip27geneknockoutparasitesarenonpathogenicandelicitlong-termprotectiveimmunityinBALB/cmiceJ.JImmunol.2013,190：2138-2149.21DeyR,NatarajanG,Bhatl

34、acharyaP,etal.CharacterizationofCross-Protectionbygeneticallymodifiedlive-attenuatedLeishma-niadonovaniparasitesagainstLeishmaniaMexicanaJ.JIm-mounol,2014,193(7):3513-3527.22 GannavaramS,SharmaP,DuncanRC.etal.MitochondrialAsuoci-atedUbiquitinFoldModifier-1MediatedProteinConjugalioninLeishmaniadonova

35、niJ.PloSONE,2011,6(1):e!6156.23 GannavaramS,ConnellyPS,DanielsMP,”al.DeletionofmitochondrialassociatedubiquitinfoldmodifierproteinUfmlinLeish-maniadonovaniresultsinlossof-oxidationoffattyacidsandblockscelldivisionintheamastigotestageJ.MolMicrobiol,2012,86(1):187-198.(24GannavaramS,SonyaD,InesLakhal-

36、Naouartetal.DeletionofubiquitinfoldmodiGerproteinufmlprocessingpeptidaseuf«pinI.,donovaniabolishesufmlprocessingandalterspathogenesisJ.PLcSNeglTropl)i».2O14,8(2)：e2707.:25:SerenoD,VergnesB,MathieuDF.eral.LookingforputativefunctionsoftheLeishmaniacytosolicSIR2deacetylaseJ.ParasitolRes,2006,

37、100：1-9.26 VergnesB,SerenoD,TavaresJ,etal.TargeteddisruptionofcytosolicSIR2deacetylasediscloscRitsessentialroleinliahmaniasurvivalandproliferationJ'.Gene,2005,363：85-96.27 SilvestreR.CordeiroDS,SantaremN,etal.SIR2-DeficientLeish-maniainfantumInducesadefienedIFN-/IL-10PatternThatCorrelateswithPro

38、tectionJ.JImmunology,2007,179(5)；3161-3170.28AntoniaziS,LimaHC.CruzAK.etal.OverexpressionofminiexongenedecreasesvirulenceofLeishmaniamajorinBALB/cmiceinvivoJ.MolBiochcmParasitol,2000,107(1)：57-69."29deToledoJS,JunqueiradosSantosAE,RodriguesdeMouraT,e/al.leishmania(Viannia)braziliensistransfecta

39、ntsoverexpresaingtheminiexongenelosevirulenceinvivoJ.ParasitologyInternational,2009,58(I)：45-50.30jSelvapandiyanA,DuncanR,DebrabantA,etal.ExpressionofamutantformofLeishmaniadonovanicentrinreducesthegrowthoftheparasite：；.JBiolChem,2001,276(46)：43253-43261.(31SelvapandiyanA.DeyR,NylenS,etal.Intracellu

40、larReplication-DeficientLeishmaniadonovaniinduceslonglastingprotectiveimmunityagainstVisceralLeishmaniaM*J.JImmunol,2009,183(3)：1813-1820.(32FiuzaJA.SantiagoHC,SelvapandiyanA,etal.InductionofimmunogenicitybyliveattenuatedLeishmaniadonovanicentrindeletedparasitesindog*J.Vaccine,2013,3】(14)：1785-1792.

41、33 FiuzaJA,GannavaramS,SantiagoHdaC,etal.Vaccinationu-singliveattenuatedLeishmaniadonovanicentrindeletedparasitesinducesprotectionindogsagainstleishmaniainfantumJ.Vac-cine,2015,33(2)：280-288.34 DattaS,AdukR,PriyankaC,etal.Radio-attenuatedleishmanialparasitesasimmunoprophylacticagentagainstexperimentalmurineviscera】leishmaniasisJ.ExperimentalParasitology,2012,130：39-47.35 DattaS.MannaM.KhanraS,elal.Therapeuticimmunizationwithradio-attenuatedLeishmaniap