如何在組織中檢測細(xì)胞增殖,分化和凋亡

1、在組織中檢測細(xì)胞增殖、分化和凋亡的方法一、 檢測細(xì)胞增殖的方法（1）直接方法：通過直接測定進(jìn)行分裂的細(xì)胞來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖力量1、 胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法 胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì)。用同位素3H標(biāo)記TdR即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過程，通過測定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DAN的代謝及細(xì)胞增殖狀況。但是具有放射性。2、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸

2、鹽基團(tuán)，使CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不行逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFsE標(biāo)記熒光可平均安排至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。這樣，在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈對(duì)遞減，利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對(duì)其進(jìn)行分析。3、Brdu檢測法 Brdu中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細(xì)胞培育加入，而后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可推斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)爭辯細(xì)胞動(dòng)力

3、學(xué)有重要意義4、增殖標(biāo)志檢測有些抗原 只存在于增殖細(xì)胞中，而非增值細(xì)胞缺乏這些抗原，您也可以通過特異性的單抗來對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測。例如，在人體細(xì)胞中，Ki-67抗體識(shí)別同名蛋白，在細(xì)胞周期S期、G2期和M期表達(dá)，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表達(dá)。用針對(duì)Ki-67蛋白的單抗就可以檢測細(xì)胞的增值狀況。由于需要組織切片，這種方法無法進(jìn)行高通量分析。不過這一方法頗受癌癥爭辯者們的青睞，由于它能夠用來檢測體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖。其他普遍使用的細(xì)胞增殖或細(xì)胞周期調(diào)控標(biāo)志還包括，增殖細(xì)胞核抗原PCNA、拓?fù)洚悩?gòu)酶IIB和磷酸化組蛋白H3。（2）間接方法：通過檢測樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖力量1、

4、MTT檢測法 MTT檢測法主要反映細(xì)胞的能量代謝，是檢測細(xì)胞增殖活力的一種簡便精確的方法，其原理是在活細(xì)胞生長和增殖過程中，線粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的甲（Formazan），生成的甲量的多少與細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞的活力成正比。2、ATP檢測細(xì)胞內(nèi)的ATP含量受到了嚴(yán)格調(diào)控，檢測ATP也可以得到細(xì)胞增殖的信息。死亡細(xì)胞或即將死亡的細(xì)胞幾乎不含ATP，在細(xì)胞溶解物或提取物中測得的ATP濃度與細(xì)胞數(shù)之間存在嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用熒光素酶luciferase及其底物熒光素luciferin的ATP檢測以生物發(fā)光為基礎(chǔ)，能夠?yàn)槟?yīng)格外靈敏的結(jié)果。假如有ATP存在熒光素酶就會(huì)發(fā)光，而且其發(fā)

5、光強(qiáng)度與ATP濃度成正比，用能讀取發(fā)光信號(hào)的光度計(jì)和酶標(biāo)儀都可以便利的進(jìn)行檢測。這種方法格外適用于高通量細(xì)胞增殖檢測和篩選。二、 檢測細(xì)胞分化的方法1、 流式鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志，以推斷細(xì)胞是否分化2、 觀看細(xì)胞形態(tài)，與已分化的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比3、 分化誘導(dǎo)評(píng)估其分化力量三、 檢測細(xì)胞凋亡的方法（1）形態(tài)學(xué)檢測1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。常用染色方法：蘇木精=伊紅染色 甲基綠-派諾寧染色：與壞死相比，細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)常有RNA表達(dá)的增加，用甲基綠特異性染色DNA，派諾寧對(duì)RNA親和力強(qiáng)，若胞質(zhì)呈派諾寧陽性為凋亡

6、，陰性為壞死。（前提是已經(jīng)推斷細(xì)胞處于死亡形態(tài)，通過形態(tài)學(xué)推斷） 吖啶橙染色法：。它與細(xì)胞中DNA和RNA結(jié)合量存在差別，可發(fā)出不同顏色的熒光，與DNA結(jié)合量少發(fā)綠色熒光，與RNA結(jié)合量多發(fā)桔黃色或桔紅色熒光。該染料具有膜通透性，能透過細(xì)胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在熒光顯微鏡下觀看，吖啶橙可透過正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光；在凋亡細(xì)胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。吖啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光，或黃綠色碎片顆粒；而壞死細(xì)胞黃熒光減弱甚至消逝。吖啶橙染液有毒，操作時(shí)要戴手套，需避光。 （凋亡小體）2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核

7、染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展?fàn)顩r。常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)放射光明的藍(lán)色熒光。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為25mg/ml。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 1mg/ml。結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變分為三期：期的細(xì)

8、胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，部分染色質(zhì)消滅濃縮狀態(tài);a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度分散、邊緣化;b期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（如圖）。3、透射電子顯微鏡觀看凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，消滅很多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(如圖)；a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度分散、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 （2）檢測凋亡標(biāo)記物質(zhì)1、磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但

9、在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依靠性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC、PE)或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。2、線粒體膜勢

10、能的檢測線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的大事，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)消滅之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不行逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6(3)、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methy

11、l ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增加或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。將正常培育的細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodamine 123(1mM)或終濃度為DiOC6(25nM)，JC-1(1mM)，TMRM(100nM)，37°C平衡30min，流式細(xì)胞計(jì)檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。3、TUNEL法細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測

12、，這類方法（稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的爭辯方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能精確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培育的細(xì)胞和從組織中分別的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的爭辯中被廣泛接受。（

13、3）DNA片斷化檢測1、大分子染色體DNA片段的測定細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50300 kbp長的DNA大片段。全部超過肯定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時(shí)，即達(dá)到辨別力的極限。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50300 kbp長的DNA大片段不能用一般的瓊脂糖凝膠電泳來分別。通常接受脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個(gè)方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向轉(zhuǎn)變后，大的DNA分子便滯

14、流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能連續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子量越大，這種重排所需要的時(shí)間就越長。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量大小分開。 2、DNA Ladder 測定細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50300 kbp長的DNA大片段, 或180200 bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，接受常規(guī)方法分別提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀看到典型的DNA ladder。假如細(xì)胞量很少，還可在分別提純D

15、NA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀看凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。3、凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計(jì)分析 （4）Caspase-3活性的檢測Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著格外重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的很多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17KD)和兩個(gè)小亞基(12KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，casp

16、ase-3的活性明顯下降。1、western blot2. 熒光分光光度計(jì)分析活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。依據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)放射熒光。依據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。（5）凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析TFAR19(PDCD5)是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增加劑。利用熒光素(FITC)標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對(duì)細(xì)胞凋亡過程中TF