抗菌肽基因及研究進(jìn)展

1、 抗菌肽基因及研究進(jìn)展 摘 要 抗菌肽是昆蟲先天性免疫系統(tǒng)中十分重要的效應(yīng)因子，近年來一直是昆蟲免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。家蠶作為鱗翅目昆蟲的代表，其抗菌肽研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。根據(jù)過去研究獲得的抗菌肽基因，并利用這些序列在家蠶基因組中進(jìn)行同源搜尋，共發(fā)現(xiàn)了40個(gè)家蠶抗菌肽基因。這些基因編碼的多肽在大小、氨基酸組成和性質(zhì)上差異很大，但基于結(jié)構(gòu)性質(zhì)可以分成3類：(1)具有-螺旋結(jié)構(gòu)并且缺乏半胱氨酸(Cysteine,Cys)的線性抗菌肽；(2)富含脯氨酸和/或甘氨酸的抗菌肽;(3)富含半胱氨酸的環(huán)形抗菌肽。本文將以這3類結(jié)構(gòu)作為主線綜述家蠶抗菌肽近年來的研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞 家蠶；抗菌肽；結(jié)構(gòu)Antimicr

2、obial Peptide Genes in Bombyx mori and Their Research ProgressSUN Wei1, SHEN Yihong1, XIANG Zhonghuai1, ZHANG Ze1，2 （1. The key Sericultural Laboratory of Agricultural Ministry, Southwest University, Chongqing 400716,China. 2. The Institute of Agricultural and Life Sciences, Chongqing 400030, China）

3、 Abstract Antimicrobial peptides are the important effectors of the innate immune system in insects, which are always the hot research of the insect immune. Silkworm is the representative of the Lepidoptera, and the researches of antimicrobial peptides in silkworm make a great progress. A local BLAS

4、T search of the silkworm genome database identified 40 antimicrobial peptide genes. Though the peptides encoded by these genes have great differences in size, amino acid composition and properties, they could be grouped into 3 categories: (1) linear peptides forming-helices and without cysteine resi

5、dues;(2) cyclic peptides containing cysteine residues;(3) peptides with an overrepresentation in proline and/or glycine residues. The review presents the main researches in the field of antimicrobial peptides from silkworm with these three aspects during these years.Key words Bombyx mori; antimicrob

6、ial peptides; structure昆蟲是一類進(jìn)化上較為低等的動(dòng)物，同時(shí)也是世界上種類和數(shù)量最多的動(dòng)物。面對(duì)大量的外源微生物的侵害，雖然沒有類似于哺乳動(dòng)物的特異性免疫系統(tǒng)，但是仍然能夠較好的生存，說明昆蟲必定有對(duì)非特異因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答的高效先天免疫系統(tǒng)。昆蟲的免疫系統(tǒng)由體液免疫和細(xì)胞免疫組成。細(xì)胞免疫主要是血細(xì)胞吞噬和消化外來異物,與高等動(dòng)物類似。黑化反應(yīng)也是昆蟲重要的細(xì)胞免疫，血淋巴和血細(xì)胞中，當(dāng)外源物侵入昆蟲血腔時(shí)，激發(fā)了絲氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)形成黑色素。這樣，當(dāng)酚氧化酶沉積在外源微生物表面時(shí)，可形成能阻止其生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)并且將其與寄主組織隔離的黑化包囊1。由于沒有抗體和補(bǔ)體系統(tǒng)，昆

7、蟲的體液免疫與高等動(dòng)物有明顯差異，主要依賴血液中的抗菌肽和蛋白質(zhì)2。當(dāng)昆蟲機(jī)體受到病原微生物侵染時(shí)，體內(nèi)的識(shí)別蛋白能夠識(shí)別微生物表面的肽聚糖或脂多糖或者其他物質(zhì)，引發(fā)絲氨酸蛋白酶和解除絲氨酸蛋白酶抑制劑的細(xì)胞外級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終在其脂肪體、血液、中腸和表皮等器官或組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMPs），進(jìn)而殺滅外源微生物1。抗菌肽(AMPs)是一類普遍存在的防御性蛋白質(zhì)，具有分子量小、理化性能穩(wěn)定和廣譜抗菌等特點(diǎn)，在昆蟲先天免疫防御系統(tǒng)中起著重要的作用。昆蟲抗菌肽常以家族的形式存在，家族內(nèi)成員間的氨基酸相似性較大，編碼AMPs的基因

8、通常以串聯(lián)重復(fù)的形式存在在同一條染色體上。目前對(duì)黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）抗菌肽的研究較為系統(tǒng)，黑腹果蠅中共有21個(gè)抗菌肽，按其序列相似性和功能性質(zhì)可以分為7類3。但根據(jù)肽鏈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，昆蟲抗菌肽又可以分為三類4：具有-螺旋結(jié)構(gòu)并且缺乏半胱氨酸(Cysteine,Cys)的線性抗菌肽；富含脯氨酸和/或甘氨酸的抗菌肽；富含半胱氨酸的環(huán)形抗菌肽。下面我們將以肽鏈結(jié)構(gòu)分類體系介紹家蠶抗菌肽基因及其研究進(jìn)展。1 家蠶抗菌肽條目 早在2004年，Cheng等人通過對(duì)家蠶基因組框架圖序列的找到了35條抗菌肽基因序列6。隨著研究的深入以及家蠶基因組精細(xì)圖的最近繪制完成，我們應(yīng)

9、用相同的方法重新搜尋了新組裝的家蠶基因組，并新找到一個(gè)cecropin基因，加上近期Wen等人（2008）研究發(fā)現(xiàn)的defensinA7，以及Kaneko等人（2008）獲得的defensinB8，家蠶共有40個(gè)抗菌肽基因(表1)。數(shù)量上遠(yuǎn)比其它已測(cè)序完成的模式昆蟲黑腹果蠅（21個(gè)），岡比亞按蚊（10個(gè)）9和蜜蜂（6個(gè)）10多。不同昆蟲所含有的抗菌肽數(shù)目差異可能與這些物種的生活習(xí)性，棲居的環(huán)境的差異有關(guān)系。 表1 家蠶的抗菌肽 Table1 Antimicrobial peptides in Bombyx mori 抗菌肽名稱基因名稱基因數(shù)目有完整ORF的基因數(shù)目抗菌活性AttacinBmat

10、t32抗革蘭氏陰性菌CecropinBmcec1212抗革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌和真菌EnbocinBmenb22抗革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌GloverinBmglv74抗革蘭氏陰性菌LebocinBmleb21抗革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌MoricinBmmor1212抗革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌DefensinBmdef22抗革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌總數(shù)4035 2 線性的具有-螺旋的抗菌肽具有-螺旋的線性抗菌肽是一類數(shù)量較多、分布較廣的抗菌肽，從低等的節(jié)肢動(dòng)物到高等的哺乳動(dòng)物中都有存在，這類抗菌肽常具有兩類特征：是陽離子性質(zhì)的肽；活性結(jié)構(gòu)具有兩親性質(zhì)，具有幾乎等量的極性氨基酸與非極

11、性氨基酸的兩親性的-螺旋對(duì)于穩(wěn)定抗菌肽結(jié)構(gòu)是十分重要的。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的-螺旋抗菌肽是鱗翅目昆蟲惜古比天蠶（Hyatophora cecropia）的Cecropin11。家蠶中屬于這種類型的抗菌肽有Cecropin、Moricin和Enbocin等三種。2.1 Cecropins家族和Enbocin家族家蠶的Cecropins是一類短多肽，對(duì)革蘭氏陰性菌有強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)革氏陽性菌的抗性較弱。自從在惜古比天蠶發(fā)現(xiàn)Cecropin以來，在鱗翅目及雙翅目昆蟲中又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了至少60種Cecropin類抗菌肽。圖1 Cecropin家族和Ebocin家族以及Attacin家族抗菌肽基因在染色體上的位置。

12、A:抗菌肽cecropin基因B-亞族，C-亞族，D-亞族和E-亞族基因以及Ebocin家族基因在第26號(hào)染色體上的位置；B:抗菌肽cecropin基因A-亞族基因BmcecA2和Attacin家族基因在第6號(hào)染色體上的位置。BmcecA1基因未能定位在染色體上。箭頭符號(hào)代表抗菌肽基因的可能的轉(zhuǎn)錄方向。Fig1 The chromosome locations of Cecropin, Ebocin and Attacin genes. A: The location of Cecropin genes (BmcecBs, BmcecC, BmcecDs and BmcecE ) and Eb

13、ocin genes on the 26th chromosome. B: The location of Cecropin genes (BmcecA) and Attacins genes on the 6th chromosome. BmcecA1 cannot be located on any chromosomes. And the arrows represent the putative transcript orientation of the antimicrobial peptides.家蠶Cecropins是一個(gè)較大的家族，共有11個(gè)成員6，按照它們的序列相似性分為5個(gè)

14、亞簇BmcecA (BmcecA1-BmcecA4),BmcecB (BmcecB1-BmcecB5),BmcecC (BmcecC)，BmcecD (BmcecD1-BmcecD2)和BmcecE (BmcecE)，除BmcecA外,其它9個(gè)Cecropins成員在家蠶基因組上串聯(lián)存在(圖1)。家蠶Cecropins由61-65個(gè)氨基酸組成,大多數(shù)沒有半胱氨酸，有兩個(gè)-螺旋結(jié)構(gòu)，如圖2所示，N-末端富含堿性氨基酸，C-末端富含疏水的氨基酸，并且在C-末端有酰胺化修飾，以此來增加Cecropin的穩(wěn)定性以及正電荷，從而提高抗菌效率12。BmcecA1和A2, BmcecB1和B2，BmcecD

15、以及BmcecE等6個(gè)已有研究，當(dāng)受到免疫誘導(dǎo)時(shí)，這些基因均有明顯的表達(dá)上調(diào)，而在正常狀態(tài)下，BmcecE與另外幾個(gè)基因的表達(dá)情況有顯著的差異13，胚胎發(fā)育時(shí)期，只有BmcecE在的胚帶分化時(shí)有一個(gè)表達(dá)峰，其他的基因無；在幼蟲期該7個(gè)基因有極少量或沒有表達(dá)；在蛹期，只有BmcecE在腸內(nèi)有表達(dá)，這些說明BmcecE可能在胚胎發(fā)育和蛹形成時(shí)期有著重要作用。另外的6個(gè)Cecropins家族成員（BmcecA3，BmcecA4和BmcecB3- BmcecB5以及BmcecC）為在家蠶基因組精細(xì)圖繪制后，利用同源比對(duì)搜尋獲得的，活性檢測(cè)尚未有報(bào)道。但是新找到的BmcecB3- BmcecB5與Bmc

16、ecB1,B2的氨基酸序列完全一致，核苷酸序列的差異也較小，只是在基因組中所處位置有所不同，推測(cè)可能具有同樣的抗菌活性。從基因組已經(jīng)測(cè)序完成的幾個(gè)模式生物來看，家蠶Cecropins家族成員數(shù)目顯著比黑腹果蠅（5個(gè)）和岡比亞按蚊（4個(gè)）多，這可能與家蠶缺乏專屬的類似于果蠅中Drosomycin的抗真菌肽有關(guān)。 圖2 家蠶Cecropin家族成員的多序列比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。紅色框表示螺旋區(qū)域，藍(lán)色框表示發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 結(jié)果由PSIPRED在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)。Fig. 2. Sequence alignment and secondary structure prediction of Cecropins

17、in Bombyx.mori. Red boxes represent helix; Blue box represents coil. The results were obtained by using the online server of the PSIPRED Protein Structure Prediction.1998年Kim等人用探針雜交的方法在家蠶中首先發(fā)現(xiàn)了Enbocin的片段14， Kaneko等人又在2007年獲得了3個(gè)Enbocin基因的全長(zhǎng)序列15。從氨基酸序列來看，Enbocin屬于Cecropins家族，可能是較早從Cecropin家族中分化出來，但是它們

18、表現(xiàn)出相反的抗菌活性，Cecropins抗革蘭氏陰性菌的能力更強(qiáng)，而Enbocin對(duì)革蘭氏陽性菌的抗性明顯強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性菌的抗性。Cheng等人在家蠶基因組中只發(fā)現(xiàn)了2個(gè)編碼Enbocin基因Bmenb1和Bmenb2，如圖1所示，這兩個(gè)基因與Cecropins 基因成簇地排列在同一條染色體上，通過對(duì)Cheng等人發(fā)現(xiàn)的2個(gè)Enbocin與Kaneko的3個(gè)Enbocin氨基酸序列比較分析， Bmenb1和Bmenb2可以與Kaneko的Bmenb3和Bmenb2一一對(duì)應(yīng)，而家蠶基因組中并未發(fā)現(xiàn)Kaneko所說的Bmenb，這可能是因?yàn)榧倚Q基因組測(cè)序并不完整所致。2.2 Moricin家族

19、Moricin是由Hara and Yamakawa（1995）首先從家蠶血淋巴中分離得到的16，它對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有強(qiáng)烈的抗菌活性。家蠶抗菌肽Moricin由65-66個(gè)氨基酸殘基組成，在其N-末端部分每隔34個(gè)氨基酸殘基就有帶電荷氨基酸，只形成1個(gè)長(zhǎng)的具有親水脂性質(zhì)的-螺旋結(jié)構(gòu)(圖3)，在C-末端則存在堿性氨基酸殘基串，而且沒有發(fā)現(xiàn)Moricin有氨基酸的修飾。其抗菌機(jī)理可能是利用堿性C端與細(xì)胞膜表面作用，然后利用N端改變膜的通透性，形成離子通道17。Moricin的等電點(diǎn)高達(dá)12.0，對(duì)細(xì)菌抗性明顯高于Cecropin家族各成員。 圖3 家蠶Moricins家族成員的多序列

20、比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè). 紅色框表示螺旋區(qū)域. 結(jié)果由PSIPRED在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)。Fig 3 Sequence alignment and secondary structure prediction of moricins in Bombyx mori. Red box represents helix. On the PSIPRED Protein Structure Prediction ServerCheng等人通過對(duì)家蠶基因組框架圖序列進(jìn)行搜尋，共發(fā)現(xiàn)了12個(gè)Moricin抗菌肽，按其序列相似性將它們分為兩類BmmorA (BmmorA1- BmmorA4)和BmmorB (BmmorB

21、1-BmmorB8) 6，其中除了BmmorA1先前有報(bào)道外，其他均為新發(fā)現(xiàn)。Moricin家族的各個(gè)成員均串聯(lián)存在于同一條染色體上(圖4)，在BmmorA家族中，BmmorA1與其它3個(gè)成員的氨基酸相似性只有30%左右，如圖3所示，另外3個(gè)成員間的氨基酸相似性則高達(dá)93%以上，我們認(rèn)為將這3個(gè)Moricin重新命名為另外的家族如BmmorC可能更為合理。BmmorB家族內(nèi)成員間以及BmmorA2-4間的氨基酸序列有很高的相似性，說明這些家族最近可能分別經(jīng)歷了多次獨(dú)立的基因重復(fù)事件。到目前為止，Moricin在其他昆蟲目中還未有發(fā)現(xiàn)，可能屬于鱗翅目特異的抗菌肽。圖4 Moricin家族抗菌肽基

22、因在家蠶第23號(hào)染色體上的位置。箭頭表示 可能的轉(zhuǎn)錄方向。Fig. 4. The location of moricin genes on the 23th chromosome. The arrows represent the putative transcription orientations of the antimicrobial peptide genes.3富含脯氨酸和/或甘氨酸的抗菌肽目前，已經(jīng)在很多昆蟲中，包括膜翅目,雙翅目，鱗翅目，鞘翅目等獲得了富含一種或兩種氨基酸的抗菌肽。常見的有富含脯氨酸以及富含甘氨酸的抗菌肽。富含脯氨酸的抗菌肽通常只對(duì)革蘭氏陽性菌起作用，而對(duì)革蘭氏

23、陰性菌沒有作用，這與其抗菌機(jī)制密切相關(guān)，與其他肽也有所不同的是，它是通過結(jié)合細(xì)菌熱休克蛋白Dna K發(fā)揮抗菌作用4。家蠶中這類抗菌肽共有三類，包括富含甘氨酸的Gloverin和Attacins以及富含脯氨酸的Lebocin。天蠶葛佬素（Gloverin）最初是由Axen等人（1997）在鱗翅目昆蟲Hyalophora gloveri蛹中發(fā)現(xiàn)的一種富含甘氨酸的抗菌肽18，其后在鱗翅目的其他幾個(gè)昆蟲種如棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)18，家蠶(Bombyx.mori) 15也相繼發(fā)現(xiàn)了相似性很高的抗菌肽分子，但在其他目的昆蟲中還未有發(fā)現(xiàn)，可能也是一類鱗翅目昆蟲特有的抗菌肽，經(jīng)活

24、性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)它是一種專門殺滅革蘭氏陰性菌的抗菌肽。它可能是通過抑制細(xì)菌某種重要的膜蛋白的合成，增加細(xì)胞膜的通透性，從而殺死細(xì)菌18?，F(xiàn)在在家蠶基因組中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)可能編碼Gloverin的基因，有6個(gè)基因?qū)儆贏亞族，一個(gè)基因?qū)儆贐亞族，Cheng等人分別將它們命名為BmglvA1，BmglvA2，BmglvA3，BmglvA4，BmglvA5，BmglvA6以及BmglvB6，均是由四個(gè)外顯子構(gòu)成，相對(duì)于前面介紹的抗菌肽基因來說是一個(gè)大基因。這些基因分布于兩條染色體上(圖5)，BmglvA6位于第17號(hào)染色體上，其他的基因均位于第28號(hào)染色體上，非常有意思的是同屬于A亞族的BmglvA6位于另一條

25、染色體上，而BmglvB則與A亞族基因定位在同一條染色體上，甚至是同一條scaffold上。在最新的家蠶基因組中只有BmglvA1，BmglvA5，BmglvA6和BmglvB有完整的基因結(jié)構(gòu)，而其他的基因只有片段15。Kaneko等人（2007）從細(xì)菌感染家蠶后建立的EST數(shù)據(jù)庫中只得到了4個(gè)Bmglv基因，我們通過同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)基因與家蠶基因組中的那4個(gè)有完整結(jié)構(gòu)的基因有很高的相似性，其它基因在家蠶基因組中只能找到片段，而且均是基因的下游區(qū)域，Cheng等人（2004）的結(jié)果表明這些片段均屬于A亞族，它們之間只有很少幾個(gè)氨基酸發(fā)生了替換，我們通過EST庫數(shù)據(jù)分析，證明了這些片段是存

26、在的并有表達(dá)證據(jù)，但是由于現(xiàn)在的家蠶EST數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)來源于多個(gè)研究機(jī)構(gòu)，而且所用家蠶品系都各不相同，因此我們不能確定這些僅有幾個(gè)氨基酸替換的Gloverin編碼基因是同一品系內(nèi)的多個(gè)重復(fù)基因，還是同一基因由于品系差異造成的氨基酸替換。而在基因組內(nèi)找不到它們完整的ORF，可能是由于基因組數(shù)據(jù)庫拼接錯(cuò)誤造成，或者存在有選擇性剪切，使得這些片段與其他基因共用上游片段，從而行使功能。Marinal等人（2008）最近對(duì)其中4個(gè)具有完整結(jié)構(gòu)的基因進(jìn)行了功能和結(jié)構(gòu)的分析20，發(fā)現(xiàn)BmglvB可能是最原始的Gloverin家族基因，BmglvA1，BmglvA5，BmglvA6均是其重復(fù)基因，并且在這種重

27、復(fù)的過程中BmglvA1，BmglvA5，BmglvA6丟失了BmglvB 3UTR所含有的一個(gè)內(nèi)含子，然而就在這一丟失的內(nèi)含子中，有一個(gè)能抑制BmglvB在胚胎時(shí)期表達(dá)的CF2調(diào)控元件，而其它基因則無該調(diào)控元件能夠在胚胎時(shí)期表達(dá)，并因此在家蠶中首次發(fā)現(xiàn)了抗菌肽Gloverin在胚胎發(fā)育過程中還具有調(diào)控作用。圖5 Gloverin家族抗菌肽基因在染色體上的位置。A：BmglvB，BmglvA1，BmglvA2，BmglvA4，BmglvA4和 BmglvA5在家蠶第28號(hào)染色體上的位置。B： BmglvA6在家蠶第17號(hào)染色體上的位置。箭頭表示可能的轉(zhuǎn)錄方向。Fig 5. The chromo

28、some location of Gloverin genes. A: The location of BmglvB，BmglvA1，BmglvA2，BmglvA4，BmglvA4和 BmglvA5 on the 28th chromosome. B: The location of BmglvA6 on the 17th chromosome. And the arrows represent the putative transcript orientation of the antimicrobial peptides.攻擊素（Attacins）主要存在于雙翅目和鱗翅目昆蟲中，分子量約為

29、20 kD，無半胱氨酸，是富含甘氨酸（一般在10%以上）類抗菌肽，主要是對(duì)增殖期革蘭氏陰性細(xì)菌具有抑菌作用，作用機(jī)制與Gloverins相似。Attacin溶解時(shí)呈無規(guī)卷曲狀態(tài)21，由于缺乏半胱氨酸所形成的二硫鍵，其構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)是松散的而且是不穩(wěn)定的，這種對(duì)結(jié)構(gòu)無嚴(yán)格的限制可能會(huì)導(dǎo)致氨基酸替換的增加，這可能是導(dǎo)致遠(yuǎn)源物種的Attacin氨基酸序列相似性低的原因。 Sugiyama等人用鱗翅目昆蟲H. Cecropia的Attacin為探針22，從家蠶cDNA文庫中分離獲得編碼家蠶Attacin蛋白的cDNA，但到目前為止還沒有從家蠶中直接分離到Attacin族抗菌肽。家蠶Attacin族共有

30、2個(gè)成員，即Bmatt1和Bmatt2，在新測(cè)序出的12種果蠅的基因組中，每個(gè)果蠅種中Attacin基因都有3或者4個(gè)，這些果蠅Attacin基因都是由2個(gè)外顯子構(gòu)成的，而家蠶中該基因有3個(gè)外顯子。果蠅和家蠶都有兩個(gè)G-domain即甘氨酸富集區(qū)，同屬于該類的雙翅肽（diptericin）和鞘翅肽（coleoptericin）只有一個(gè)G-domain23，家蠶中兩個(gè)G-domain是由兩個(gè)外顯子編碼而成的，而其他的幾個(gè)肽雙翅肽，鞘翅肽包括含有兩個(gè)G-domain的果蠅Attacin都是由一個(gè)外顯子編碼的。Lebocin是一類富含脯氨酸的抗菌肽，有的也常含有高比例的精氨酸或賴氨酸。在已有的報(bào)道中

31、，家蠶中共有4類編碼Lebocin基因24，Bmleb1，Bmleb2，Bmleb3和Bmleb4，但是我們?cè)诩倚Q基因組中只發(fā)現(xiàn)了Bmleb3，并在EST數(shù)據(jù)庫中找到了在基因組中所沒有的Bmleb4，另外兩個(gè)基因還未有發(fā)現(xiàn)，可能是包含這兩個(gè)基因的基因組序列并未測(cè)出所致。Bmleb1，Bmleb2和Bmleb3編碼的抗菌肽都有編碼后修飾過程，Bmleb1和Bmleb2編碼的氨基酸序列完全相同，只是修飾氨基酸上的修飾糖不同。它們與另兩個(gè)序列間也只是有幾個(gè)氨基酸的替換。4 富含半胱氨酸的環(huán)形抗菌肽富含半胱氨酸的抗菌肽是生物體內(nèi)分布最為廣泛的一類，常具有較強(qiáng)的抗菌活性，是生物先天性免疫的重要組成部分。

32、半胱氨酸在分子內(nèi)常常兩兩間結(jié)合形成二硫鍵，對(duì)于維持分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性很有幫助，根據(jù)含有二硫鍵數(shù)量又可以將其分為兩類：(1)含有一個(gè)二硫鏈的多肽，這類抗菌肽的數(shù)量較少。第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的是牛中性粒細(xì)胞的Bactenecin25，其12個(gè)氨基酸中含有4個(gè)精氨酸，在其第2位和第11位氨基酸殘基間形成二硫鍵。Bactenecin對(duì)革蘭氏陽性和陰性菌都有活性。昆蟲中該類抗菌肽也較少，最為常見的是從半翅目昆蟲刺肩蝽（Podisus maculiventris）分離出來的Thanatin26，Thanatin含有兩個(gè)線性的折疊，由一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，它的N-末端變化較大，而C-末端是一個(gè)穩(wěn)定的陽性環(huán)狀結(jié)構(gòu)

33、（稱為insect box）；(2)含有兩個(gè)或兩個(gè)以上二硫鍵的多肽這類多肽的典型代表是Defensins4，最初發(fā)現(xiàn)的defensins來源于哺乳動(dòng)物的組織中，一般含有2934個(gè)氨基酸殘基，其中6個(gè)穩(wěn)定的半胱氨酸形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。昆蟲Defensin成熟肽區(qū)是個(gè)典型的Cs-/結(jié)構(gòu)，N-末端有3個(gè)轉(zhuǎn)角和1個(gè)轉(zhuǎn)角，中間有一個(gè)兩親性的-螺旋，C-末端有一個(gè)反向平行的折疊組成。從序列上分析不同昆蟲的Defensin差異是較大的，但通常含有6或8個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，能形成3或4個(gè)二硫鍵。黑腹果蠅中還含有一類只有抗真菌活性的肽Drosomycin，該家族中共有7個(gè)成員，分子內(nèi)有4個(gè)二硫鍵維持結(jié)構(gòu)，成

34、員間的氨基酸序列相似性較高，僅有某些氨基酸位點(diǎn)的替換或缺失，但這種少量的氨基酸位點(diǎn)變化就使得成員間的抗菌譜產(chǎn)生了很大的差異27。家蠶的富含半胱氨酸的環(huán)形抗菌肽最近才開始有研究，2008年Wen等人通過RT-PCR獲得了家蠶Defensin(BmdefA)的cDNA7，這也是至今家蠶中分離得到的第一個(gè)富含半胱氨酸的環(huán)形抗菌肽，BmdefA同樣含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基。通過預(yù)測(cè)Bmdef的等電點(diǎn)是4.14，屬于陰性的抗菌肽，一般的抗菌肽都是陽性的，以此來與外源微生物的陰性表面相結(jié)合從而發(fā)揮作用，顯然陰性的BmdefA不能通過這種方式殺滅外源微生物，其殺菌機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。Kaneko等人（

35、2008）在研究家蠶抗菌肽時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的Defensin（BmdefB），BmdefB擁有典型的富含半胱氨酸抗菌肽的特征，即含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，但是它與BmdefA在氨基酸水平上只有27%的相似性，如圖6所示，而且是一種陽性抗菌肽，表達(dá)模式也有較大的差異，系統(tǒng)發(fā)生分析表明它們可能來自不同的祖先。圖6 昆蟲富含半胱氨酸類抗菌肽的多序列比對(duì)。Sfgal是指鱗翅目昆蟲草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）的抗菌肽Gallerimycin, Hvdef是指鱗翅目昆蟲煙芽夜蛾（Heliothis virescens）的抗菌肽Defensin。Fig 6 Sequence ali

36、gnment of cyclic peptides containing cysteine residues in insect. Sfgal is the AMP Gallerimycin in the Spodoptera frugiperda; Hvdef is the AMP Defensin in the Heliothis virescens.5 總結(jié)家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)類昆蟲，2007年我國(guó)絲綢出口就達(dá)89.24億美元28。然而家蠶也是一種較為脆弱的昆蟲，我國(guó)蠶繭生產(chǎn)過程中通常因蠶病減產(chǎn)達(dá)20%左右，嚴(yán)重的達(dá)80%，甚至顆粒無收29。因此，對(duì)家蠶免疫學(xué)的研究是十分有意義的。家蠶是

37、種較為低等的動(dòng)物，免疫系統(tǒng)僅由初級(jí)的先天性免疫組成，而抗菌肽因其各種優(yōu)良的理化性質(zhì)成為先天性免疫系統(tǒng)中的重要組成部分。家蠶基因組數(shù)據(jù)獲得后，Cheng等（2004）通過同源搜尋的方法在家蠶中找到了35個(gè)抗菌肽基因6，第一次較為系統(tǒng)地研究了家蠶抗菌肽基因，我們應(yīng)用同樣的方法并綜合近年來的研究，共在家蠶中總結(jié)出了40個(gè)抗菌肽基因，按照他們之間的序列相似性可以分為7個(gè)家族（Cecropin，Moricin，Gloverin，Attacin，Enbocin，Lebocin和Defensin），雖然這7個(gè)家族之間在大小，氨基酸組成和性質(zhì)等方面相差很大，但根據(jù)肽鏈結(jié)構(gòu)特征可以分為3類：(1)具有-螺旋結(jié)構(gòu)

38、并且缺乏半胱氨酸(Cysteine,Cys)的線性抗菌肽，主要有Cecropin，Moricin和Enbocin；(2)富含脯氨酸和/或甘氨酸的抗菌肽，如Gloverin，Attacin和Lebocin;(3)富含半胱氨酸的環(huán)形抗菌肽，家蠶中近來只發(fā)現(xiàn)有Defensin。家蠶的40條抗菌肽基因很多只是通過生物信息學(xué)的方法分析獲得，它們中的很多的功能研究還未有報(bào)道，因此對(duì)它們的抗菌活性的研究必定會(huì)成為研究的熱點(diǎn)。2006年Yang等人對(duì)果蠅抗真菌肽Drosomycin 7個(gè)成員的抗菌活性分析表明27，某些關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸對(duì)于活性是十分重要的，并且一個(gè)家族內(nèi)成員的抗菌活性是有差異的，這給我們提供了

39、很好的借鑒。家蠶內(nèi)有3個(gè)大的抗菌肽家族Cecropins，Moricins和Gloverins，研究這3個(gè)家族內(nèi)各成員的抗菌活性差異，對(duì)尋找活性相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)有幫助，將為以后進(jìn)行抗菌肽人工改造提供理論依據(jù)。參考文獻(xiàn) ( Reference )1Lemaitre B, Hoffmann J. The host defense of Drosophila melanogaster J. Annu Rev Immunol , 2007, 25 : 697-7432 Kimbrell D A, Beutler B. The evolution and genetics of innate immun

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