植物細胞學(xué)分析之組織切片技術(shù)

1、植物細胞學(xué)分析之組織切片技術(shù) 一、試劑（1）卡諾氏固定液：無水乙醇與冰醋酸按體積比為3:1混合配制。（2）1molL鹽酸溶液：取濃鹽酸（比重1.19）82.5ml，加入蒸餾水917.5ml。（3）醋酸洋紅染液：4-5g洋紅，冰醋酸45ml，蒸餾水55ml，先將冰醋酸加入蒸餾水中煮沸，然后將火移去，立刻加入洋紅，用玻璃棒攪勻溶化，冷卻后過濾即成。（4）70%酒精；95%酒精。二、細胞分析方法1有絲分裂全過程的染色體制片方法步驟：取材-預(yù)處理-固定-根尖解離1mol/L HCL-醋酸洋紅染色-壓片（1）發(fā)根挑選每份黑麥種子材料25粒，經(jīng)流水沖洗，放于培養(yǎng)皿內(nèi)溫水浸泡24h。置于25恒溫箱中發(fā)根。待

2、根長到12cm時，于適宜時間用蒸餾水洗凈，將水吸干，剪取根尖0.51cm進行預(yù)處理。為獲得盡可能多的分裂相，根尖以上午910時剪取為宜。（2）預(yù)處理為了有利于有絲分裂中，染色體的觀察和計數(shù)，通常要對材料進行不同的預(yù)處理。預(yù)處理主要通過抑制和破壞紡錘絲的形成，來獲得更多的中期分裂相，同時還可以改變細胞質(zhì)的粘度，促使染色體縮短和分散，便于壓片和觀察。將根尖浸于蒸餾水內(nèi)，1-4低溫處理24h。（3）固定材料經(jīng)預(yù)處理后，用流水沖洗2次，然后投入卡諾液（3份甲醇1份冰乙酸）中固定26h，用95的乙醇洗兩次，轉(zhuǎn)入70乙醇中保存?zhèn)溆茫?）。固定的目的是： 迅速防止細胞死亡后的變化，如自溶、腐敗等，盡量保持生

3、長狀態(tài)結(jié)構(gòu)。使細胞中的蛋白質(zhì)、脂肪等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持生前的形態(tài)。使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，便于觀察和鑒定。使不同組織成分對染料有不同的親和力，便于染色。防止細胞過度收縮或膨脹，失去原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。（4）解離 常用酸解法：從70乙醇中取出固定好的根尖，用蒸餾水沖洗后，吸水紙吸干，放入盛有1 mol/L 的HCl的1.5ml離心管中，60水浴，恒溫條件下解離10min。植物細胞的細胞壁對細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)起支撐和保護作用，分生組織的細胞壁結(jié)構(gòu)將分生細胞結(jié)合成一個整體，因此在壓片之前需要采用適當(dāng)方法軟化或部分分解細胞壁使細胞間易于分離，這一操作稱為解離。同時，解離也可適當(dāng)清除部分

4、細胞質(zhì)，使細胞質(zhì)背景趨于透明化，便于觀察染色體。通過解離和壓片，分生細胞的原生質(zhì)體能夠從細胞壁里壓出，使染色體周圍不帶有細胞質(zhì)或僅有少量細胞質(zhì)，讓后續(xù)制片處理直接作用于染色體。（5）染色 解離后吸出HCL，用蒸餾水水洗2次，每次3-5分鐘，將根尖置于載玻片中間，切去根冠，從乳白色分生組織切取盡可能薄的一片，滴加12滴品紅染液，染色5min。（6）壓片 在經(jīng)染色的材料上加一滴染液，在染液左側(cè)放一刀片，蓋上蓋玻片，用鑷子垂直敲打，先輕輕敲出蓋玻片下的空氣，然后邊敲邊向外移動刀片，待刀片移出蓋玻片后，覆一層吸水紙，用鑷子垂直敲打 (注意勿使蓋片搓動)，待材料分散均勻后，將玻片拿到酒精燈火焰上烤，烤至

5、稍燙手為宜，然后迅速用拇指按住蓋玻片，用力壓。（7）鏡檢 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少數(shù)，因此壓片后要認真仔細地進行鏡檢。先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細觀察、記數(shù)、拍照。調(diào)節(jié)可調(diào)節(jié)可變光欄與反光鏡，使光線明暗合適，視場亮度適中。注意觀察有絲分裂全過程的染色體形態(tài)變化，找出染色體分散好的中期細胞進行染色體計數(shù)，對好的分裂圖像作上標(biāo)記，以便再觀察。2染色體核型分析方法選擇分散良好的中期染色體在顯微鏡下拍照分析，染色體計數(shù)至少觀察統(tǒng)計50個完整的中期分裂相。核型分析至少測量5個細胞的染色體，參照李懋學(xué)和陳瑞陽確定的標(biāo)準5.染色體的相對長度、臂比及類型參照Leven等命名系

6、統(tǒng)6。核型類型參照Stebbins標(biāo)準7。染色體相對長度系數(shù)參照Kuo（1972）8標(biāo)準。（1）準備染色體標(biāo)本的相片于顯微鏡下選出5個中期分裂相中染色體數(shù)目完整、分散良好、著絲點清晰、無重疊、各條染色體處于同一平面，并且著色鮮明、形態(tài)清晰、著絲粒明顯、隨體明顯可見的細胞（如果染色體帶有隨體），通過顯微攝影、沖洗、放大成染色體相片。（2）染色體測量目測相片上每條染色體長度，按長短順序初步編號，寫在每條染色體相片背面，用游標(biāo)卡尺測量每條染色體長度（總長、長臂長、短臂長；著絲點一分為二算入兩臂），有隨體的染色體可計入全長，也可不計入，但必須加以說明。將測量的數(shù)據(jù)分別記錄。（3）根據(jù)測量結(jié)果換算出各條

7、染色體的相對長度、臂比及著絲粒位置，并根據(jù)臂比值確定染色體類型。 染色體長度絕對長度（或?qū)嶋H長度，均以微米表示）=放大的染色體長度（毫米）放大倍數(shù)×1000染色體相對長度（均以百分比表示）=染色體長度染色體組總長度×100%染色體長度比：最長染色體長度最短染色體長度染色體相對長度系數(shù)=染色體長度全組染色體平均長度臂比=長臂短臂著絲點位置：以上述臂比值確定。參照Levan（1964）的命名，如表1所示：表1 染色體臂比值、著絲點位置與染色體類型 臂比值著絲點位置表示符號1001.011.701.713.003.017.007.0以上正中著絲點中部著絲點區(qū)近中著絲點區(qū)近端著絲點

8、區(qū)端部著絲點區(qū)端部著絲點MmsmsttT臂指數(shù)：即把具中部和近部著絲點的“V”形染色體計算為兩個臂，而把具近端和端部著絲點的“J”或“I”形染色體計算為一個臂。以此來統(tǒng)計核型中的總比數(shù)。著絲點指數(shù)=短臂長度染色體全長×100核型不對稱系數(shù)=長臂總長/全組染色體總長核型分類：Stebbins（1971）參照生物界現(xiàn)有的核型資料，根據(jù)核型中染色體的長度比和臂比兩項主要特征，用以區(qū)分核型的對稱和不對稱程度，并將其分為12種類型，如表2所示。（4）配對排列根據(jù)測量數(shù)據(jù)，比較染色體的大小、形狀、相對長度、臂比、著絲粒指數(shù)、次縊痕的有無及位置、隨體的有無等特征，將照片上的各個染色體分別剪下并進行同源染色體的配對。將配對的染色體按由大到小的順序進行排列并編號，排列時短臂在上，長臂在下。對于等長的染色體，以短臂長的在前。將排列好的染色體組型圖進行翻拍并描繪出染色體組型圖。表2 核型類型標(biāo)準最長最短臂比大于2：1的染色體的百分比0.00.010.50.510.991.0：11A2A3A4A2：14：11B2B3B4B：4:11C2C3C4C（5） 核型分類根據(jù)Stebbins的按核型中最長染色體與最短染色體之比及臂比大于2的染色體所占比例、Ar