目的基因的獲取

1、實驗報告 題目:單元一:目的基因的獲取 指導(dǎo)老師:譚紅銘 張?zhí)碓?日期:2013/10/17一實驗?zāi)康模?1) 掌握總RNA的提取方法和技術(shù)(2) 了解總RNA的提取要注意的問題(3) 了解用RT-PCR法獲取功能基因的原理(4) 學(xué)習(xí)和掌握RT-PCR的技術(shù)方法二實驗原理：(1) RNA提?。篟NA在細(xì)胞中是與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的。提取RNA時需先用強變性劑使蛋白質(zhì)和DNA變性，同時抑制核糖核酸酶(RNase)的活性，然后通過有機溶劑如氯仿分層抽提去掉蛋白質(zhì)和多糖等，最后通過RNA沉淀劑如異丙醇的幫助下沉淀分離RNA。(2) RT-PCR：總RNA中的mRNA體外在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下可合成與mR

2、NA互補的單鏈DNA，稱為互補DNA（cDNA），再在DNA聚合酶的作用下，以cDNA第一鏈為模板，以四種脫氧核苷酸（dNTP）為材料，在引物的引導(dǎo)下，合成大量雙鏈DNA。三實驗材料： 斑馬魚、Trizol Reagent（Invitrogen）、DEPC處理的超純水（0.02-0.1%）、氯仿、異丙醇、無水乙醇、高速離心機、各種規(guī)格的RNase Free的槍頭、EP管（1.5ml）、RNase Free的燒杯及量筒玻璃棒等、新開的大濾紙、碎冰及泡沫冰盒4 實驗準(zhǔn)備： 由于實驗過程中實驗者手、臂上的細(xì)菌和真菌，人體自身分泌的RNase如手汗和唾液會帶入試管或污染用具，使RNA降解，因而實驗一開

3、始就必須自始至終佩帶口罩及乳膠手套，并經(jīng)常更換。5 實驗步驟、現(xiàn)象、結(jié)果及分析：總RNA提?。喝“唏R魚一條，用濾紙吸干水，至于電子秤平內(nèi)稱重，為0.293g，后置于研缽，用大勺子往其中加入液氮，待其冷凍后，開始研磨，使其始終保持粉末狀，由于液氮揮發(fā)，需補充液氮，直至徹底研磨至面粉狀細(xì)末為止。在研缽內(nèi)粗略將粉末分成三份，每份約80mg，再用液氮冷卻過的小不銹鋼勺子挑取其中一份加入預(yù)先裝有1mlTrizol試劑的管中，劇烈震蕩使之分散均勻，分裝三份，標(biāo)號1、2、3，本實驗中由于存在小塊凝結(jié)，因而使用移液槍吹打使之分散均勻。室溫靜置5min，待其反應(yīng)完全，讓Trizol充分作用，使核蛋白質(zhì)解聚；加入

4、200l氯仿，劇烈震蕩15sec，室溫靜置5min，可看到試管內(nèi)分兩層，上層透明水相層為RNA層，下層紅色有機相為DNA和蛋白質(zhì)層；使用高速離心機在12,000g，離心15min，使分層徹底；小心吸取上層水相（含RNA）約500-600l轉(zhuǎn)移入另一干凈離心管，使用200l和100l槍頭轉(zhuǎn)移，寧少勿多，切勿吸到中間層。加入500l異丙醇(沉淀RNA)，輕柔顛倒多次混勻，室溫靜置10min；再次使用高速離心機在12,000g，離心15min；取出試管后發(fā)現(xiàn)底部出現(xiàn)白色沉淀，小心用移液槍吸取上層廢液，并用槍頭吸干，加入500l75%乙醇(需用RNase Free水配制)洗滌沉淀，輕柔顛倒幾次；使用高

5、速離心機在7,500g，離心5min；小心用移液槍吸取上層廢液，并用槍頭吸干，在實驗桌面墊上干凈濾紙，將試管管口打開，平臥其上，另一濾紙蓋在其上，室溫下干燥，從一側(cè)觀察試管底部白色沉淀，待其剛好消失(透明)為止；加入30lddH2O(RNase Free水)溶解，置冰上保存?zhèn)溆?。鑒定RNA純度、濃度： 取3l總RNA樣品，直接加在檢測儀的加樣板其中一個孔上，吸頭不能碰到加樣板，以RNase Free水為空白對照，測定濃度及A260/A280。表一：吸光度測定組別A260A280A260/A280濃度(ng/l)12.5511.3801.8492040.93323.6782.0311.81129

6、42.24632.5101.2611.9902007.803 由于260nm、280nm下的吸光度分別代表了核酸和蛋白等有機物的值，當(dāng)A260/A280的比值介于1.8-2.0時，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者其他有機物的污染是可以容忍的。本實驗三組比值均介于該范圍內(nèi)，證明所提RNA純度較高。鑒定RNA完整性:RNA電泳檢測：(1) 制備瓊脂糖凝膠:稱取瓊脂糖1g，加入1TAE緩沖液液中，帶水合數(shù)分鐘后，置微波爐中高火1min將瓊脂糖融化均勻，加熱時蓋上封口膜以減少水分蒸發(fā)。(2) 將樣品槽梳子插進(jìn)托盤長邊上的凹槽內(nèi)(距一端約1.5cm)，梳齒底邊與托盤表面保持0.5-1mm的間隙。(3) 待凝膠溶

7、液冷卻至50左右時，輕輕倒入電泳制膠版上，除掉氣泡。(4) 凝膠冷卻凝固后，拔出梳子，將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入電泳緩沖液，使其液面剛高出瓊脂糖凝膠。(5) 桌面鋪一層薄膜，取RNA樣品1l，加RNase Free水3l，SYBR Gold燃料1l，6Loading Buffer1l，用槍頭吹打混勻，后吸取加放凝膠點樣孔中，點樣孔靠近電源負(fù)極(黑色)一端，用120v電壓電泳。(6) 電泳完畢，取出凝膠，在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后的電泳膠板，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之，電泳照片如下圖一所示： 1 2 328srRNA18srRNA圖一：總RNA電泳示意圖 由上圖可以看出，2號組亮度較

8、1、3組高，因其RNA濃度最大。2號組28s和18s條帶明亮、清晰，并且28s的亮度在18s的兩倍以上，證明RNA的完整性較好。1號組和3號組不太清晰，但28s的亮度約在18s的兩倍以上。逆轉(zhuǎn)錄PCR：(1) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)： 取事先按下表二實配量配制的反應(yīng)液120l混勻后分裝PCR管，每管9l，并加入各組別RNA樣品1l，放入PCR儀中，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。表二：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系每管/組(l)實配(l)10RT Buffer112MgCl2224dNTP Mixture(各10pmol/l)112RNase Inhibitor0.253AMV Reverse Transciptase0.56Oligo

9、 dT-Adaptor Primer(2.5pmol/l)0.56RNase Free H2O 3.7546RNA Sample(500ng total RNA)1Total10120(2) PCR擴增目的基因： 取事先按下表三實配量配制的反應(yīng)液600l混勻，往完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試管中每管加入40l，再放入PCR儀中，進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。表三：PCR反應(yīng)體系每管/組(l)實配(l)5PCR Buffer10120上游特異引物(10pmol/l)112下游特異引物(10pmol/l)112滅菌蒸餾水27.75333Taq酶0.253cDNA一鏈(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)10Total50600 PCR反應(yīng)條件

10、如下: step1 94變性 2 min step2 94變性 40 sec step3 60復(fù)性 40 sec step4 72延伸 40 sec step5 72溫育 5 min step6 4 保存 step2-4運行30個循環(huán)。電泳檢測擴增產(chǎn)物： 反應(yīng)結(jié)束后，往每管PCR產(chǎn)物中加入6Loading Buffer10l，混勻，后每管取出3l點在桌面薄膜上，同樣marker組也取樣3l，然后各加入SYBR Gold1l，用槍頭吹打混勻，后吸取加放凝膠點樣孔中，點樣孔靠近電源負(fù)極(黑色)一端，用120v電壓電泳。電泳完畢后，取出凝膠，在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后的電泳膠板，于凝膠成

11、像系統(tǒng)中拍照并保存之，電泳照片如下圖二所示： M 1 2 3500bp M：DNA marker 1、2、3：mRNA的RT-PCR產(chǎn)物圖二：RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳示意圖 由上圖可以看出擴增產(chǎn)物很明顯，三組條帶均于同一處顯示出亮條紋，與marker亮條紋所處位置一致，證明目的基因擴增正常。剩下的PCR產(chǎn)物統(tǒng)一置于-20冰箱保存。6 實驗報告要求與思考題(1) 計算所提取的總RNA的A260/A280值以及濃度。 見表一(2) 寫出3種常用的RNA酶的抑制劑及其作用機理。答：1.異硫氰酸胍，對RNA酶有強烈的變性作用;2.焦炭酸二乙酯(DEPC)，通過與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性；3.RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑（RNasin），是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶緊密結(jié)合形成復(fù)合物從而使其失活。(3) 附上RNA電泳結(jié)果的圖片并進(jìn)行正確的標(biāo)注。 見圖一(4) 瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響。答：1.DNA分子構(gòu)象，超螺旋DNA移動得最快，而開環(huán)狀DNA移動得最慢；2.DNA分子大小，分子越大，所受阻力越大，移動越慢；3.電源電壓，4.離子強度等。(5) 如果樣品電泳后很久都沒有跑出點樣孔，你認(rèn)為有哪幾方面的原因。答：1.誤用蒸餾水配置凝膠；2.電源接觸不良；3.凝膠樣品中