植物分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展

1、植物分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展推動分子系統(tǒng)學(xué)發(fā)展的主要因素是：1.分子生物學(xué)方法的不斷改進(jìn)；2.基因組的全序列測定；3.用于分子系統(tǒng)學(xué)研究的基因種類不斷增加，對這些基因進(jìn)化規(guī)律的認(rèn)識不斷深入；4.化石DNA的研究等，本文將對這些因素作簡要的介紹。1.分子系統(tǒng)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)1.1 DNA的制備核酸的分離與提取是分子生物學(xué)研究中最重要的基本技術(shù)之一，核酸樣品的質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。Goelz等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)，是用機(jī)械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，進(jìn)入含SDS和高濃度蛋白酶K（mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進(jìn)行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA雖不完整，但可被限

2、制性內(nèi)切酶切割，因而適于點(diǎn)雜交，印跡雜交等多種分了生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改進(jìn)。 首先通過組織切片和二甲苯和脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細(xì)胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，從而提DNA質(zhì)量，適于做Sorthern印跡雜交分析。Moerkerk等（1990）對上述兩種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法所提行DNA之點(diǎn)雜交結(jié)果一致，非螺旋化DNA亦不影響雜交分析。不同類型的基因分析所要求的DNA質(zhì)量和數(shù)量不同。Southern 印跡雜交分析需要1015

3、g大片段DNA（>20kb），因?yàn)殡s交前要進(jìn)行相誚的限制性內(nèi)切酶消化和凝膠分離不同片段長度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）則可在相對粗制的小片段DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）則可在相對粗制的小片段DNA樣本上進(jìn)行，分析所需的DNA很少，0.5g甚至更少即可。PCR的模板DNA制備方法很多，除上述兩種方法外，還有更簡便的直接水煮法（Slebos,et al,1990；Smit, et al, 1988 ）、 蛋白酶消化法（Impraimet al.1987；Brice,et al.19

4、89）。固定劑對DNA的影響固定劑的類型直接影響提取DNA的質(zhì)量。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的中性緩沖福爾馬林固定的標(biāo)本，DNA保存完好，可以獲得高分子量DNA。Watford等（1988）對甲醛固定過程中DNA變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)核酸對甲醛反應(yīng)性可分為兩個(gè)階段：早期出現(xiàn)堿基快速可逆轉(zhuǎn)羥甲基化；數(shù)天后堿基對間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯(lián)。DNA提取過程中的蛋白產(chǎn)K消化，酚/氯仿抽提和純化等步驟，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性質(zhì)改變。Barmwell等（1988）發(fā)現(xiàn)，甲醛和戊二醛固定可使得DNA產(chǎn)量降低，醋酸甲醇（MAA）可導(dǎo)致DNA明顯降解。Michel's運(yùn)輸保存液或PBS

5、存放組織雖提取DNA純度高，但產(chǎn)量得明顯降低。Dubeau等也觀察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker，Bs）處理標(biāo)本不能獲得完整的DNA。乙醇被認(rèn)為是保存核酸的最佳固定劑。Wu等（1990）用無水乙醇固定標(biāo)本48h，最長達(dá)2年，均可得到中量的高分子DNA。Sato等（1990）用AMex方法處理組織，既可保存許多抗原成分，亦可使大分量DNA完好無損。1.2 PCR在RFLP及序列分析中的應(yīng)用。PCR技術(shù)自1985年建立以來，發(fā)展之迅速、應(yīng)用之廣泛，表明其具有強(qiáng)大的生命力.近些年來，基于PCR的基本原理，許多學(xué)者充分發(fā)揮創(chuàng)造性思維，對PCR技術(shù)進(jìn)行研究和改進(jìn)，使PCR技

6、術(shù)得到了進(jìn)上步地完善，并在此基礎(chǔ)上派生出了許多新的用途。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件在體外酶促合成特異DNA片段的循環(huán)反應(yīng)，可使目的DNA片段得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置于高溫(約93-95)下使之變性解鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫(約50-70)下分別與目的DNA片段兩側(cè)的互補(bǔ)序列復(fù)性結(jié)合；引物在DNA聚合酶作用（約70-75）下沿模板按53方向延伸，合成目的DNA片段的新互補(bǔ)鏈。如此經(jīng)過n個(gè)周期，理論上擴(kuò)增2n倍,一般PCR經(jīng)30-40周期后可獲得百萬倍以上的目的DNA。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長度多態(tài)（PCRRFLP）分析技術(shù)是在PCR

7、技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。DNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)上，使酶切位點(diǎn)增加或者消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴(kuò)增包含堿基置換的這段DNA，經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來確定是否變異。應(yīng)用PCRRFLP，可檢測某一致病基因已知的點(diǎn)突變，進(jìn)行直接基因診斷，也可以此為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析進(jìn)行間接基因診斷。PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。此項(xiàng)技術(shù)大大提高了目的DNA的含量和相對特異性，而且

8、方法簡便，分型時(shí)間短。2基因組的全序列測定目前應(yīng)用的兩種快速序列測定技術(shù)是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學(xué)降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點(diǎn)，但卻隨機(jī)終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個(gè)堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會均等，因些上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區(qū)分長度僅差一個(gè)核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中

9、若干個(gè)相鄰的泳道這上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。因?yàn)橹参飳τ谌祟惖囊率匙⌒杏兄艽蟮年P(guān)系，因此對植物分子生物學(xué)的研究往往集中于一些重要糧食作物如水稻、小麥等及經(jīng)濟(jì)作物如油萊、大豆等。有人曾對基因庫（GenBank）中有關(guān)植物的數(shù)據(jù)作了統(tǒng)計(jì)，其中有90的DNA序列來自22種植物，而另外10則來自于30種植物，這些研究一般都是針對某種植物的某個(gè)基因作的詳細(xì)研究。植物的葉綠體基因組相對較保守，很多植物基因已被用于分子系統(tǒng)學(xué)研究中，在此簡單介紹葉綠體基因組的測序進(jìn)展。葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器。早在1909年，就有人根據(jù)高等植物葉片的花斑性狀的非孟德爾遺傳現(xiàn)象

10、, 推測葉綠體內(nèi)存在著遺傳物質(zhì)。然而, 直到1962年，人們才利用電鏡技術(shù)首次證實(shí)了葉綠體DNA（cpDNA）分子的存在。十年后，才分離到cpDNA。已知的葉綠體基因組大小約為120-160kb，盡少數(shù)綠藻的cpDNA的大小超出這個(gè)范圍。到目前為止，已有6種高等植物的葉綠體基因組完成了全序列測定，這6種植物的cpDNA的差異見下表。葉綠體基因組編碼了它自身使用的全部rRNA和tRNA，但是僅編碼了葉綠體上幾百種蛋白和多肽的一小部分葉綠體上絕大多數(shù)蛋白復(fù)合體是由核基因組和葉綠體基因組共同編碼的。我們可以把cpDNA上的基因分成以下四類：由中國科學(xué)家領(lǐng)銜的白菜、甘藍(lán)和油菜全基因組測序項(xiàng)目取得階段性

11、重大成果,獲得了白菜全基因組的精細(xì)圖,甘藍(lán)和油菜全基因組的框架圖。研究表明，白菜、甘藍(lán)和油菜的基因組大小分別約為5億、6.5億和11億個(gè)堿基對,白菜和甘藍(lán)含有的基因總數(shù)目分別約4.2萬和4.5萬個(gè),油菜基因覆蓋度85%以上。該項(xiàng)成果是國際上首次對三個(gè)近緣作物物種進(jìn)行的整體測序,并且油菜是迄今首個(gè)全基因組測序的異源四倍體植物,這不僅對研究作物進(jìn)化和遺傳改良有著重大意義,也對其他多倍體物種的全基因組測序具有重要的參考價(jià)值。3用于分子系統(tǒng)學(xué)的主要基因種類及其進(jìn)化規(guī)律31 葉綠體基因組葉綠體是植物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器, 具有自身獨(dú)立的遺傳體系, 它編碼的物質(zhì)參與光合作用、氨基酸、核苷酸、脂肪酸等生物合成

12、過程。葉綠體DNA(cpDNA)具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單和有獨(dú)立的進(jìn)化路線等優(yōu)點(diǎn),加之葉綠體基因相當(dāng)保守, 因而對cpDNA的重要基因進(jìn)行分析, 可從進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育上,揭示物種親緣關(guān)系和闡述生物遺傳多樣性, 并已有大量關(guān)于利用細(xì)胞器DNA或基因(rbcl,ndhFmatk等基因)來進(jìn)行遺傳與進(jìn)化的研究和報(bào)道。小麥葉綠體基因組中infA-rpl36區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物, 對多個(gè)小麥族植物, 包括在栽培小麥遠(yuǎn)緣雜交與染色體工程育種中廣泛選用的黑麥、簇毛麥和偃麥草屬等物種的DNA進(jìn)行了擴(kuò)增、測序和系統(tǒng)分析, 以期為小麥族中重要物種的遺傳多樣性與小麥育種提供指導(dǎo)。利用小麥葉綠體基因組中infA-rpl36

13、區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物, 對小麥(Triticeae)的12個(gè)二倍體和多倍體的物種進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和序列測定, 獲得了長度584603 bp的12條DNA序列。序列分析表明, 供試物種在infA-rpl36基因間隔區(qū)的核苷酸變異明顯高于基因編碼區(qū)?；蚓幋a區(qū)核苷酸序列同源性高達(dá)97%, 表明了目標(biāo)片段具有高度的保守性。但在5個(gè)物種的infA編碼區(qū)出現(xiàn)了較大的插入、缺失突變, 導(dǎo)致推導(dǎo)的氨基酸序列也發(fā)生了很大的變化, 證實(shí)了infA基因是葉綠體基因組中最活躍的基因之一, 而rpl36基因的變異較小, 說明不同葉綠體基因的進(jìn)化速度是不同的?；跍y定序列建立的種系樹分析發(fā)現(xiàn), 多倍體物種中間偃麥草(Th

14、inopyrum intermedium)具有多種不同的細(xì)胞質(zhì)起源, 與核基因組一樣在進(jìn)化上較為復(fù)雜。3.2 線粒體基因組在植物的系統(tǒng)與進(jìn)化研究中，相對于葉綠體和核基因片段來說，線粒體基因片段由于其分辨率較低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜而較少應(yīng)用到系統(tǒng)學(xué)研究中。在植物系統(tǒng)發(fā)育重建中，來自葉綠體基因組的DNA片段和來自核基因編碼核糖體的DNA,片段（nuclear ribosomal DNA）是兩個(gè)最主要的分子證據(jù)來源（OlmsteadPalmer,1994,Solits Solits，1998；Alvarez Wendel,2003）, 近年來, 單拷貝或低拷貝的核基因片段被越來越多地用于不同等級的系統(tǒng)發(fā)育重建

15、研究中，為系統(tǒng)發(fā)育重建研究提供了更為重要的信息來源（Clegg et al.,1997;Ge et al.,1999;Sang,2002）。相比之下，利用來自植物線粒體基因組的DNA片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究仍十分有限，一方面是因?yàn)橹参锞€粒體基因組的進(jìn)化速率比葉綠體基因組更慢從而提供的進(jìn)化信息有限(Wolfe et al.,1987), 另一方面由于植物線粒體基因組在大小和結(jié)構(gòu)上十分不穩(wěn)定（高頻率重排、重復(fù)或缺失以及外源DNA的轉(zhuǎn)入等），這些都制約了其在植物系統(tǒng)發(fā)育研究中的廣泛應(yīng)用(Palmer,1992;AdamsPalmer，2003)。但最新的研究表明，植物線粒體基因組中有些片段是相對比較穩(wěn)定

16、的，如與呼吸代謝有關(guān)的基因（包括cob、cox1、nad1、nad4和nad5）(Adams Palmer,2003)，而且植物線粒體中許多基因存在進(jìn)化較快的內(nèi)含子，加上被子植物線粒體是母系遺傳，因此某些線粒體DNA片段信息同樣提供了重要的進(jìn)化信息（Demesure et al.,1995）,在植物系統(tǒng)發(fā)育重建、居群生物學(xué)和生物地理學(xué)研究中有許多成功的報(bào)道（Qiu Palmer,1999;Mitton et al.,2000;Gugerli et al.,2001; Sanjur et al.,2002）。如nad1基因編碼線粒體呼吸傳遞鏈的復(fù)合體I泛醌氧化還原酶（NADH：ubiquinon

17、e oxidoreductase;也可稱NADH脫氫酶）的nad1亞基，是一個(gè)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定的線粒體基因，在迄今已研究過的物種中由5個(gè)外顯子構(gòu)成（nad1/A-E）(Gutierres et al.,1999)。4 化石DNA的研究以色列魏茲曼研究院的科學(xué)家在骨骼化石中發(fā)現(xiàn)了保存完好的遠(yuǎn)古時(shí)代的DNA。這一成果發(fā)表在近期出版的美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)上。 化石DNA是保存人類和動物進(jìn)化、種群動態(tài)、遷徙及食物和疾病信息的潛在資源，但如果得不到很好的保存或被現(xiàn)代DNA污染，將很難破譯。保存在化石和考古材料中的古DNA，由于受水解和氧化等降解因子的影響，總是以高度片段化、小分子量的形式存在于古代樣

18、品中?；疍NA的保存好壞與其所在環(huán)境的溫度、pH值、濕度、液體的離子濃度及埋藏時(shí)間等因素有關(guān)，一般來說干燥、低溫的環(huán)境下可以保存較好的化石DNA1986年，維勒第一次在新鮮骨骼中發(fā)現(xiàn)了晶體物的存在。當(dāng)時(shí)，研究人員將骨頭磨碎，并用可以清除所有有機(jī)物的次氯酸納進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)，骨頭中的晶體族被完整地保留了下來，晶體中的有機(jī)物也未受影響。20年后，研究人員再次利用這一發(fā)現(xiàn)推理出，化石晶體可能擁有這種晶體結(jié)構(gòu)，而且這種結(jié)構(gòu)蘊(yùn)藏著古代的DNA?；疍NA的研究過程自20世紀(jì)90年代以來就沒有大的變化：即在提取實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行多次常規(guī)PCR反應(yīng)及分子克隆，經(jīng)測序后獲得一系列古DNA片段，然后拼合成一條完整的序列化石中的晶體集合體實(shí)際上形成了一個(gè)特殊的小環(huán)境，保護(hù)著DNA免遭周邊惡劣環(huán)境的影響，使它們能夠在一個(gè)相當(dāng)長的時(shí)間里不會受到破壞。研究人員還發(fā)現(xiàn)