兩種凝血酶原提取方法的比較

1、兩種凝血酶原提取方法的比較                            作者：賴翼 吳民瀘 代娟 陳曼 段佳慧 劉陽【摘要】【關(guān)鍵詞】  凝血酶原； 凝血酶； 等電點(diǎn)沉淀法； 檸檬酸鋇吸附法    【Key words】  prothrombin；  thro

2、mbin；  method of precipitating at isoelectricpoint；  adsorption method with barium citrate    凝血酶是參與機(jī)體凝血過程的一個重要的凝血因子，在體內(nèi)以凝血酶原形式存在1。20世紀(jì)中期開始人們將凝血酶應(yīng)用于臨床，由于其療效顯著，應(yīng)用也越來越廣泛。之后美英日等國從牛血漿中分離出凝血酶應(yīng)用于臨床，并證明將動物凝血酶應(yīng)用于人體未出現(xiàn)凝血酶抗原性，口服和局部外用時無過敏反應(yīng)和其他不良反應(yīng)等，因而目前所使用的凝血酶制劑大多來源于動物血漿，國內(nèi)采用豬血漿制備凝血酶的報

3、道較多2。等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法3，凝血酶原經(jīng)單獨(dú)的鈣離子激活可得到凝血酶。目前，國內(nèi)尚無研究比較應(yīng)用等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法所得到的凝血酶原純度的差異，哪種方法得到的凝血酶原純度更高？更適合用于提取凝血酶原?本文對這兩種方法從豬血漿中提取凝血酶原的純度進(jìn)行了比較。為相關(guān)實(shí)驗(yàn)中選擇合適的凝血酶原提取方法提供。    1  材料與方法    1.1  材料    檸檬酸鈉抗凝的新鮮豬血漿。    1.2  主要

4、試劑    纖維蛋白原和凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品購自美國SIGMA公司，Bradford蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自美國BioRad。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。    檸檬酸鋇吸附法使用的四種溶液分別為，溶液A：1.0 mol/L BaCl2溶液； 溶液B：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L BaCl2，0.10 mol/L NaCl，pH7.4； 溶液C：0.02 mol/L Tris， 0.10 mol/L NaCl，0.20 mol/L Na2EDTA，pH7.4； 溶液D：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L

5、NaCl，pH6.5.    1.3  主要儀器    GE GeneQuant 1300核酸蛋白分析儀。1             1.4  方法    凝血酶效價測定4,5：取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品，用生理鹽水配制成效價(U/mL)分別為5、6、7、8、9、10的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。另取1×10 cm的塑料試管6支，各加入0.1 %纖維蛋白原溶液450 l，置37水浴預(yù)熱5 min

6、，再分別取已37預(yù)熱的上述6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 l，迅速加入上述各試管中，立即計時并搖勻，記錄凝固時間。每個濃度測2次，求平均值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品用生理鹽水稀釋適當(dāng)濃度，取50 l，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法平行測定2次，求平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程樣品的效價。    根據(jù)文獻(xiàn)6，采用Bradford法測定樣品的蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，每個樣本平行測2次，取平均值。根據(jù)公式：酶比活性=酶效價/溶液蛋白質(zhì)濃度，計算凝血酶溶液的比活性。    2  結(jié)果與分析    以凝血酶標(biāo)準(zhǔn)

7、品溶液效價 (U/mL)為X，對應(yīng)的凝固時間（sec）為Y進(jìn)行直線回歸處理，并求得直線回歸方程，所得方程式為：Y=62.9135.994X，r0.994 8.將凝血酶樣品的凝固時間代入回歸方程，即可計算得出樣品的凝血酶效價(見表1、圖1)。    采用等電點(diǎn)沉淀法得到的凝血酶原經(jīng)激活后，凝血酶的比活性為11.01±1.54 U/mg，而采用檸檬酸鋇吸附法提取得到的凝血酶原經(jīng)激活后，凝血酶的比活性可達(dá)到130.17±12.30 U/mg。其比活性經(jīng)配對樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計學(xué)分析后，其概率P=3.54×1050.01，說明兩種方法得到的凝血酶比

8、活性有顯著性差異，后者約為前者的11.8倍。從兩種方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白質(zhì)濃度分析，造成兩者酶比活性差異的主要原因在于凝血酶的純度差異，凝血酶純度越高，比活性就越高。等電點(diǎn)沉淀法提取的凝血酶原溶液含雜蛋白較多，需要進(jìn)一步純化，以提高酶的比活性。因而，采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原大大優(yōu)于等電點(diǎn)沉淀法，得到的凝血酶純度較高。    3  討論    從血漿中提取的凝血酶可應(yīng)用于臨床，作為局部止血的首選藥物，具有止血快、無副作用的優(yōu)點(diǎn)。同時，凝血酶也是纖維蛋白原定量檢測試劑盒的主要成分，應(yīng)用于出凝血疾病和

9、血栓性疾病的臨床檢測7。由于人血漿資源的限制性，目前國內(nèi)采用豬血漿提取凝血酶的報道較多，等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法，凝血酶原經(jīng)單獨(dú)的鈣離子激活即可得到凝血酶。表1  兩種提取方法所得到的凝血酶比活性    等電點(diǎn)沉淀法根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液pH為其等電點(diǎn)的條件下溶解度最低的原理，用1 %的醋酸將適當(dāng)稀釋后的血漿pH調(diào)至凝血酶原的等電點(diǎn)5.05.5之間，即可使凝血酶原析出。該方法雖然操作簡便，成本較低，但得到的凝血酶含雜蛋白較多，比活性低，達(dá)不到臨床藥物和檢測試劑的純度要求，還需要進(jìn)一步的純化，而純化步驟越多，酶的回收率則相應(yīng)降低，

10、不能有效的利用資源。    檸檬酸鋇吸附法則根據(jù)檸檬酸鋇能吸附依賴于維生素K的凝血因子這一特性，在檸檬酸鈉抗凝獲得的血漿中加入氯化鋇產(chǎn)生檸檬酸鋇，凝血酶原等因子隨之沉淀分離出來，沉淀用EDTA解吸附，離心去沉淀，上清液經(jīng)透析后獲得凝血酶原溶液。雖然該方法看似操作較為復(fù)雜，但得到的凝血酶純度較高，可直接用于檢測試劑的制備，也可根據(jù)目的選擇進(jìn)行中度純化，相比等電點(diǎn)沉淀法其回收率更高，實(shí)際上節(jié)約了成本。    另外，無論是等電點(diǎn)沉淀法還是檸檬酸鋇吸附法，最后含有凝血酶原的蛋白沉淀的復(fù)溶過程是影響凝血酶得率的一個關(guān)鍵步驟。在檸檬酸鋇吸附法中，用EDTA解吸附凝血酶原應(yīng)在冰浴中攪拌0.5 h以上，直至溶液呈現(xiàn)膠凍狀態(tài)為止，使凝血酶原充分溶解于緩沖液中?！疚墨I(xiàn)】  1 張智明.凝血酶的研究進(jìn)展J.海峽藥學(xué),2006,18(6): 13.2 施大林,陸茂林,呂惠敏,等.豬血凝血酶的制備J.生物技術(shù),2002,12(1): 18.3 宋宏新,馬永征,李敏康.凝血酶分離純化方法的研究進(jìn)展J.食品研究與開發(fā),2004,25(6): 6567.4 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥典三部M.北京: 化學(xué)