豬傳染性胃腸炎病毒基因工程疫苗研究進(jìn)展.docx

1、吱物技木通報(bào)綜述與專論BIOTECHNOLOGYBVLLETIN豬傳染性胃腸炎病毒基因工程疫苗研究進(jìn)展楊恒夏雪山李盛陶陳偉(昆明理工大學(xué)牛.命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明650224)插要：豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎4(TGEV)引起豬的一種高度接觸性腸道疾病，可導(dǎo)致仔豬發(fā)生產(chǎn)童的嘔吐、腹瀉與脫水，死亡率可達(dá)100%?？诟挂呙缡荰GEV基因工程疫苗研允的主要方向，目前巳在蹤病毒、加藺、捋也因技物及DNA疫苗中對(duì)TGEV的S基因進(jìn)行了表達(dá)，并對(duì)其口服免疫后的免疫原性進(jìn)行研究?，F(xiàn)針對(duì)TGEV基因工程疫苗近年來研究的概況進(jìn)行綜述，分析其優(yōu)點(diǎn)與不足，并對(duì)其未來的發(fā)展進(jìn)行展望。關(guān)鍵詞：豬傳染牲胃腸炎病毒基

2、因工程疫苗口服免疫ResearchProgressofTransmissibleGastroenteritisVirus(TGEV)GeneticEngineeringVaccineYangHengXiaXueshanLiShcngtaoChenWei(CollegeofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650224)Abstract：Porcinetransmissiblegastroenteritisisahighlycontagious,entericdiseaseofswine

3、causedbytransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV).Thediseaseisespeciallysevereinbabypigslessthantwoweeksold,characterizedbyvomiting,severediarrhe-a,andnearly100%mortality.NewdevelopmentsofTGEVgeneticengineeringvaccinehavefocusedonproductionanddeliveryoftheSproteinthroughoralimmunization.Atpresent,seve

4、ralsystemssuchasadenovirus,bacteria,transgenicplant,andDNAvaccinehavebeenusedtoexpresstheTGEVSproteins.Afteroralimmunization,theimmunogenicityofthesevaccineshasbeenstudied.TheresearchprogressofTGEVgeneticengineeringvaccinewerereviewedinthisarticle,itsadvantage,disadvantageandfurtherdevelopmentwereal

5、soprospected.Keywords:TransmissiblegaslroenteritisvirusGeneticengineeringvaccineOralimmunization收稿日期：2010-10-08基金項(xiàng)目：云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)lj(2010ZC058)作者筒介：楊恒.男.博士.講師.研究方向：動(dòng)物傳染病學(xué)與病毒分子生物學(xué)；E-mail：yaMheng2008.cool豬傳染性胃腸炎(transmissiblegastroenteritisofswine,TGE)是由冠狀病毒科(coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)豬傳染性胃腸炎病毒(tran

6、smissiblegastroenteritisvirus,TGEV)引起豬的一種高度接觸性腸道疾病c該病以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和失水為特征，各種年齡和品種的豬均易感，尤其是兩周齡以內(nèi)的仔豬感染后致死率可高達(dá)100%,該病是導(dǎo)致世界各養(yǎng)豬國(guó)家仔豬早期死亡的重要疫病之一。近年來，隨著TGEV流行危害的進(jìn)一步加劇，我國(guó)各地不斷有從豬場(chǎng)分離出該病毒的報(bào)道f2_4Jo每年冬季和早春寒冷季節(jié)TGEV常呈爆發(fā)性流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生法典中，豬傳染性胃腸炎被列入B類傳染病，是我國(guó)法定重點(diǎn)防控的疫病之一。1豬傳染性胃腸炎病毒的致病機(jī)理TGEV無論通過口腔還是鼻腔途徑感染，病毒都被吞咽

7、入消化道。在消化道中TGEV能抵抗低pH和蛋白酶水解而保持活性.直至與高度易感的小腸上皮細(xì)胞接觸。病毒通過分布于小腸上皮細(xì)胞表面的氨基肽酶N(porcineaminopeptidaseN,pAPN)")和大小約200kD的黏蛋白型糖蛋白(mucin-typeglycoprotein,MGP)兩種受體句，特異性侵入小腸絨毛上皮細(xì)胞并在其中大量增殖，導(dǎo)致上皮細(xì)胞死亡并大國(guó)脫落，小腸絨毛顯著萎縮。由于小腸內(nèi)的酶活性明顯降低，擾亂機(jī)體正常的消化和腸上皮細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與電解質(zhì)的運(yùn)輸，引起急性吸收不良綜合癥。同時(shí)，對(duì)于新生仔豬而言，小腸黏膜上皮細(xì)胞的損害，導(dǎo)致產(chǎn)生乳糖酶的酶類機(jī)制受阻，妨礙了糖類

8、的分解吸收，腸管內(nèi)的滲透壓增高，導(dǎo)致液體的滯留，甚至從機(jī)體組織中吸收液體，引起病豬失水、代謝性酸中毒，發(fā)生腹瀉和脫水。最后，仔豬由于脫水和代謝性酸中毒以及由于高血鉀而引起的心、腎功能衰竭導(dǎo)致死亡。2TGEV的免疫保護(hù)機(jī)制及目前主要防控措施TGEV感染后康復(fù)豬的攻毒試臆表明，腸道黏膜局部免疫應(yīng)答，尤其是針對(duì)TGEV的slgA抗體可有效中和病毒從而阻止病毒對(duì)小腸絨毛上皮細(xì)胞的感染。雖然仔豬在出生后即具備產(chǎn)生黏膜抗體免疫應(yīng)答的能力，但需較長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到成年豬抗體免疫應(yīng)答的產(chǎn)生水平。因此，試圖通過給仔豬疫苗接種，使其在出生后關(guān)鍵的頭幾天快速產(chǎn)生抗TGEV感染的主動(dòng)免疫應(yīng)答希望不大。被動(dòng)免疫在保護(hù)新生仔

9、豬免受TGEV感染中起著至關(guān)重要的作用，特別是母豬乳汁中的slgA抗體可有效抵抗胃腸道中蛋白酶水解，在抗TGEV感染中起著關(guān)鍵作用。妊娠母豬乳腺中產(chǎn)生slgA抗體的漿細(xì)胞來源于腸道相關(guān)淋巴組織（GALT）,它被腸道中的抗原物質(zhì)激活后進(jìn)一步移行至乳腺定植，并將IgA抗體分泌至初乳和常乳中1891o因此，通過“腸-乳腺”免疫軸的激活，激發(fā)母豬乳汁中slgA抗體產(chǎn)生，是保護(hù)仔豬免受TGEV感染的一個(gè)主要途徑。目前對(duì)TGEV感染尚無有效的治療藥物，疫苗接種仍然是該病的主要防控措施。在生產(chǎn)中使用最為廣泛的疫苗為TGEV弱毒苗，在免疫方式上主要采取懷孕母豬的肌肉注射和口服免疫。肌肉注射雖可有效激發(fā)懷孕母豬

10、血清中IgG抗體的產(chǎn)生，但由于無法激活GALT,因此不能有效激發(fā)母豬乳汁中slgA抗體的產(chǎn)生，往往不能給仔豬提供有效的免疫保護(hù)。懷孕母豬口服弱毒疫苗免疫似乎是激發(fā)GALT的一個(gè)合理的方式，但效果尚不理想。其主要原因在于致弱后的病毒在小腸只能進(jìn)行極為有限的增殖，導(dǎo)致對(duì)GALT中產(chǎn)生slgA抗體的漿細(xì)胞的抗原刺激較少，相應(yīng)乳汁中IgA抗體分泌也較少。此外，在使用弱毒疫苗時(shí)，另一個(gè)值得注意的問題是弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)和散毒的潛在危險(xiǎn)?；谏鲜鰡栴}，進(jìn)一步研究簡(jiǎn)便、安全、能有效激活GALT的TGEV基因工程疫苗仍然十分必要。3豬傳染性胃腸炎病毒基因工程疫苗研究TGEV可編碼3種主要結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（

11、S蛋白）、膜內(nèi)在（M）蛋白和核衣殼（N）蛋白。S蛋白為高度糖基化蛋白，突出于病毒粒子囊膜表面，其上含有宿主細(xì)胞氨肽酶N（pAPN）的識(shí)別位點(diǎn)，在病毒感染、發(fā)揮致病性和決定宿主細(xì)胞親嗜性等方面起關(guān)鍵作用【'°-。S蛋白的N端包含了A、B、C和D4個(gè)主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定位點(diǎn)，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生TGEV中和抗體的主要區(qū)域UJ5o研究表明，S蛋白N端可激發(fā)與全長(zhǎng)S蛋戶|相當(dāng)?shù)闹泻涂贵w的產(chǎn)生"6）。在TGEV的3個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白是唯一能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白，因此S基因成為TGEV基因工程疫苗研究的首選抗原基因。同時(shí)，為有效激發(fā)腸道黏膜免疫應(yīng)答，

12、口服疫苗成為TGEV基因工程疫苗研究的重點(diǎn)。因此，目前已在多種不同的載體系統(tǒng)中對(duì)全長(zhǎng)或截短的S蛋白進(jìn)行了表達(dá)，并對(duì)其口服免疫后的免疫原性進(jìn)行了研究。3.1以病毒為載體表達(dá)S蛋白腺病毒易于培養(yǎng)純化，病毒產(chǎn)址高，在腺病毒基因組中特定區(qū)域內(nèi)插入外源DNA,不影響病毒增殖，而且還能使外源基因良好表達(dá)。口服重組腺病毒后，可誘導(dǎo)較強(qiáng)的系統(tǒng)免疫反應(yīng)與局部的黏膜免疫應(yīng)答。因此，腺病毒較早作為TGEV口服基因工程疫苗的活載體。Torress等如用人腺病毒5（AD5）為載體，構(gòu)建了系列表達(dá)S基因不同片段的更組腺病毒，將表達(dá)A-D4個(gè)主要抗原位點(diǎn)的重蛆朕病毒通過口鼻和腹膜途徑接種豬，可誘發(fā)豬血清中TGEV中和抗體的

13、產(chǎn)生。將免疫后的豬血清與致死劑質(zhì)的TGEV混合后口服接神乳豬，可被動(dòng)地減少仔豬的腹瀉和死亡，但不能抵抗TGEV的感染。這說明重組腺病毒口鼻和腹膜途徑接種豬后產(chǎn)生的抗體效價(jià)不高，不能完全中和病毒。由于采用人腺病毒作為動(dòng)物病毒載體存在安全問題，因此Tuboly等回采用豬腺病毒（PAdV-5）分別構(gòu)建了表達(dá)全KS基因和S基因5'端約2.2kb的重組豬腺病毒，從中篩選出3個(gè)重蛆腺病毒經(jīng)口接種易感豬。結(jié)果表明,重絹腺病毒同時(shí)誘發(fā)了針對(duì)TGEV和PAdV-5的特異性血清IgG抗體，且在免疫豬的小腸和肺臟中檢測(cè)到TGEV分泌型IgA抗體，但用TGEV對(duì)接種豬進(jìn)行攻毒，其結(jié)果如何有待進(jìn)一步研究。3.2

14、 以細(xì)菌為載體表達(dá)S蛋白隨著以腸道細(xì)菌為活載體傳遞抗原進(jìn)而激發(fā)腸道粘膜免疫這一技術(shù)路線的提出，研究者也試圖在腸道菌中表達(dá)TGEV的S蛋白，進(jìn)行重組活菌的口服免疫。目前研究主要集中在減毒沙門氏菌、乳酸桿菌等腸道曲上。與活病毒載體疫苗相比，其優(yōu)勢(shì)在于細(xì)菌培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，成本低廉。Smerdou等將編碼TGEVS$白氨基端、按基端、中間段以及全長(zhǎng)S蛋白的4個(gè)基因片段分別插入原核表達(dá)質(zhì)粒pYA292(asd+)中,轉(zhuǎn)化入減毒鼠傷寒沙門氏菌乂3987(asd-、cya-和crp-)中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明，編碼S蛋白氨基端與全長(zhǎng)S賀白的基因片段能在沙門氏菌中穩(wěn)定表達(dá)，且兩種重組菌在體外連續(xù)繁殖50代后仍有60

15、%和20%的重組菌能持續(xù)表達(dá)S蛋白氨基端與全長(zhǎng)S蛋白。將表達(dá)S蛋白氨基端的重組沙門氏菌口服免疫豬后，細(xì)菌在空腸中定植的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)10-20d,在豬的血液和唾液中均檢測(cè)到TCEV特異抗體。Smerdou等)還將不同拷貝數(shù)的S蛋白D抗原位點(diǎn)與大腸桿菌熱不穩(wěn)定B毒素亞基在減毒鼠傷寒沙門氏菌X3987中進(jìn)行了融合表達(dá)，將重組菌口服免疫家兔后可誘導(dǎo)血清中TGEVIgG抗體和腸道黏膜中TGEVslgA抗體的產(chǎn)生，但在小腸中sl-gA抗體滴度較低。除在沙門氏菌的胞質(zhì)中進(jìn)行TGEVS蛋白的表達(dá)外，研究者也在沙門氏菌的菌毛上對(duì)S蛋閂的抗原位點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)mm。其優(yōu)勢(shì)在于表達(dá)的抗原蛋白直接位于細(xì)菌的表面.能更好地刺激免

16、疫應(yīng)答。但由于是將抗原位點(diǎn)嵌合在菌毛中表達(dá)，因此只能表達(dá)很短的一段抗原肽，這極大地限制了特性抗體應(yīng)答的強(qiáng)度。H。等*:在乳酸桿菌中成功進(jìn)行了TGEVS蛋白N端約75kD的重組蛋白的分泌表達(dá)。將重組萌口服免疫小敏后，可檢測(cè)到接種的小鼠產(chǎn)生了針對(duì)TGEV的特異性血清IgG和IgA,誘導(dǎo)的抗體具有一定的TGEV中和活性。唐麗杰等網(wǎng)也報(bào)道，將表達(dá)TGEVS蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫可激發(fā)腸道黏膜產(chǎn)生抗TGEVIgA抗體c轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)S蛋白近年來，植物基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，將病原微生物的抗原基因在農(nóng)作物中進(jìn)行表達(dá)，研制可食疫苗成為當(dāng)前植物基因工程研究的一個(gè)重要方向。在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中表達(dá)抗原蛋白進(jìn)行

17、口服免疫具有成本低廉、免疫途徑簡(jiǎn)單，疫苗存儲(chǔ)無需冷藏設(shè)備，可大范圍給藥等優(yōu)點(diǎn)勺。Comez等】將分別編碼TGEVS蛋白氨基端與完整S蛋白的基因片段與花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子組成表達(dá)盒，通過基因重組將表達(dá)盒整合入擬南芥植物基因組中。結(jié)果表明，整合入植物基因組中的S蛋白得以表達(dá)。從轉(zhuǎn)基因擬南芥葉子中提取的重組蛋白免疫小融后可激發(fā)血清中TGEV抗體的產(chǎn)生，且抗體具有一定的中和活性。Gomez等又在轉(zhuǎn)基因馬鈴磬表達(dá)了TGEVS蛋白的氨基端區(qū)域(N-gS),將從馬鈴薯塊莖中提取出的重組N-gS蛋白通過腹膜內(nèi)途經(jīng)免疫小鼠，接種的小鼠產(chǎn)生了針對(duì)TGEV的特異性血清IgG,而且用表達(dá)N-gS的馬鈴

18、薯塊莖直接飼喂小鼠時(shí)，小鼠也產(chǎn)生了針對(duì)S糖蛋白特異性血清抗體。Lamphear等皿構(gòu)建了表達(dá)S基因的轉(zhuǎn)基因玉米，用該轉(zhuǎn)基因玉米種籽飼喂母豬，母豬血清、初乳和常乳中均檢測(cè)到TGEV抗體的產(chǎn)生。3.3 S基因DNA疫苗研究DNA疫苗免疫后能有效激發(fā)細(xì)胞免疫與體液免疫，具有安全可靠、便于多價(jià)苗和多聯(lián)苗研制、制備工藝簡(jiǎn)單及存儲(chǔ)運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于多種疫病的疫苗研究中，并取得良好的試驗(yàn)效果月前，對(duì)于TGEVS基因的DNA疫苗，已進(jìn)行了初步的研究。任曉峰等以真核表達(dá)質(zhì)粒pCI為載體，構(gòu)建了含S基因主要抗原位點(diǎn)的DNA疫苗，肌肉注射免疫小鼠后可誘導(dǎo)小鼠血清中特異性TGEVIgG抗體的產(chǎn)生，顯示了良好

19、的免疫原性。近年來，以減毒細(xì)菌為載體攜帶DNA疫苗進(jìn)行口服免疫被證實(shí)是激發(fā)黏膜免疫的一種理想途徑:本研究構(gòu)建了含S基因主要抗原位點(diǎn)的真核表達(dá)質(zhì)粒PVAX-S,進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌SL7207中，構(gòu)建了攜帶TGEVS基因DNA疫苗的重組沙門氏菌SL7207(pVAX-S)o將重組沙門氏菌口服免疫小鼠后.結(jié)果表明，除可有效激發(fā)免疫小鼠血清中特異性TGEVIgG抗體的產(chǎn)生，也可有效激發(fā)免疫小鼠腸道中slgA抗體的產(chǎn)生4問題與展望盡管目前在TGEV基因工程疫苗研究上取得了可喜的成果，但上述幾種形式的TGEV基因工程仍存在-些不足。以腺病毒作為載體，一方面其外源基因容量較小難以克隆大片段或多個(gè)外

20、源基因的表達(dá)；另一方面由于表達(dá)蛋白大小受限，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腺病毒大蛋白的強(qiáng)烈應(yīng)答，可能消弱外源蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)七在腸道細(xì)菌中表達(dá)抗原蛋白其缺陷在于細(xì)菌中表達(dá)的抗原蛋白無法進(jìn)行正確的翻譯后修飾與慵基化，這極大地影響表達(dá)賀白的免疫原性；同時(shí)，重蛆細(xì)菌在體內(nèi)存活時(shí)間，赍白在細(xì)菌中的表達(dá)最、穩(wěn)定性等問題也仍需進(jìn)一步研究與完善'偵。轉(zhuǎn)基因植物疫苗目前尚待解決的問題主要有兩個(gè)：一是轉(zhuǎn)基因植物中抗原蛋向表達(dá)量:普遍較低，限制了食入轉(zhuǎn)基因植物后激發(fā)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度；二是轉(zhuǎn)基因植物中的抗原蛋白在通過胃腸道時(shí)容易受到降解而喪失其免疫原性以減毒沙門氏菌攜帶DNA疫苗曰服免疫，存在免疫后機(jī)體內(nèi)細(xì)菌攜帶

21、的高拷貝質(zhì)粒迅速丟失的情況，同時(shí)針對(duì)沙門氏菌載體的免疫應(yīng)答將消弱其傳遞的DNA疫苗免疫效果叫。綜上，在TGEV口服基因工程疫苗的研究中，目前選用的載體系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，但尚沒有合適的載體系統(tǒng)能同時(shí)滿足以下3點(diǎn)：（1）S蛋白能大址的表達(dá)；（2）表達(dá)的S蛋白能有效進(jìn)行翻譯后修飾、折疊；（3）有效避開胃腸道對(duì)表達(dá)的S蛋白的消化降解。冠狀病毒是自然界最大的單股正鏈RNA病毒，對(duì)TGEV全長(zhǎng)cDNA克隆的拯救成功，是RNA病毒反向遺傳研究的一個(gè)重要突破。Almazan等叫在TGEV的感染性cDNA克隆的基礎(chǔ)上進(jìn)行了基因置換，將來源于呼吸道嗜性的弱毒株基因組全長(zhǎng)cDNA克隆中的S基因替換為具有腸嗜性強(qiáng)毒株的

22、S基因，結(jié)果所拯救的病毒是具有腸嗜性的強(qiáng)毒株，這表明可通過反向遺傳技術(shù)來改變TGEV的組織嗜性和毒力。Izeta等順將創(chuàng)造一個(gè)來自TGEV和呼吸道毒株嵌合的病卷用于表達(dá)S蛋白，如果能把它充分致弱，這種嵌合病毒有望成為候選TGEV疫苗C參考文獻(xiàn)I 斯待勞BE.主編.趙德明.張中秋，沈建忠，洋.豬病學(xué)(第8版)M.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2000:306-338.2j陳煥春，劉超,金梅林.等.豬傳染性當(dāng)腸炎病健的分島鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).1992.1(11):82-86.3 任曉嶺,李一經(jīng)，賈永清，等.豬傳染性肖腸炎病毒國(guó)內(nèi)分離株S基因克隆及與國(guó)外株的同源性比較.中國(guó)獸醫(yī)科技,2002.32(

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