淀粉酶活力的測定方法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上淀粉酶活力的測定方法淀粉酶主要包括-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它們廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物界。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。植物中最重要的淀粉酶是 -淀粉酶和-淀粉酶。 -淀粉酶隨機(jī)作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分 -1,4糖苷鍵，單獨(dú)使用時(shí)最終生成寡聚葡萄糖、-極限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使-淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸，pH 3.6 以下可使其鈍化。 -淀粉酶從非還原端作用于-1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的 -1,6鍵時(shí)停止。單獨(dú)作用時(shí)產(chǎn)物為麥芽糖和-極限糊精。-淀粉酶是一種巰基酶，不需要 Ca 2+ 及 Cl 等輔助因子，最適p

2、H偏酸，與 -淀粉酶相反，它不耐熱但覺耐酸，60 保溫15min可使其鈍化。通常提取液中 -淀粉酶和-淀粉酶同時(shí)存在。可以先測定（ + ）淀粉酶總活力，然后在60 加熱 15 min ，鈍化-淀粉酶，測出 -淀粉酶活力，用總活力減去 - 淀粉酶活力，就可求出 - 淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸的顯色反應(yīng)來測定。還原糖作用于黃色的 3,5- 二硝基水楊酸生成棕紅色的 3- 氨基 -5- 硝基水楊酸，生成物顏色的深淺與還原糖的量成正比。以每克樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的還原糖（麥芽糖）量表示酶活大小。1 酶活測定方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(見下表)取7支2

3、0 ml具塞刻度試管,預(yù)先潔凈滅菌干燥,編號(hào),按表加入試劑。搖勻,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷卻,加蒸餾水定容至20 ml,以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn),在520 nm的波長下比色測定吸光度值。并建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。表1 標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液成分表及OD測定值試劑1234567麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.20.61.01.41.82.0H2O（mL）2.01.81.41.00.60.203,5-二硝基水楊酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0麥芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.0OD520(2)粗酶液淀粉酶活力測定待測粗酶液的制備：發(fā)酵24 h后

4、發(fā)酵液4000 r/ min離心10 min,去除菌體，在上清液中加入65飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4鹽析2h，然后5000r/min離心20min，得到初步純化的淀粉酶。按以下順序操作：取預(yù)先潔凈滅菌干燥試管,編號(hào)。取粗酶液1 ml于各只試管中，于60水浴中預(yù)熱5min檸檬酸淀粉緩沖液同時(shí)在60水中預(yù)熱5min，取檸檬酸淀粉緩沖液1ml加入試管中,于60水浴中保溫30min加入1.5 ml 3,5-二硝基水楊酸,沸水中5 min,加入氫氧化鈉溶液終止反應(yīng),加蒸餾水至20 ml。搖勻,用分光光度計(jì)測定OD520 nm值。在上述條件下以單位體積樣品在30 min釋放1 mg麥芽糖所需的

5、酶量為一個(gè)麥芽糖單位表示酶活性。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量按下列公式計(jì)算酶活力酶活力測定公式： 淀粉酶活力=麥芽糖含量（mg）·淀粉酶原液總體積（mL）/所加淀粉質(zhì)量每個(gè)樣品按下表所示步驟操作，在反應(yīng)過程中，從加入底物開始，向每支管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對(duì)一致：表2樣品酶活力測定步驟反應(yīng)順序樣品（重復(fù)3個(gè)）樣品空白標(biāo)準(zhǔn)空白樣品稀釋液（ml）110蒸餾水00160預(yù)熱5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.51.5混合60保溫30min依次加入DNS試劑（ml）1.51.51.5混合100煮沸5min加入0.4mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)加入蒸餾水至總體積（ml）2020

6、20反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機(jī)上以4,000rpm離心10min，上清液以標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零，在分光光度計(jì)520nm波長處測定樣品空白（A0）和樣品溶液（A）的吸光值，AA0為實(shí)測吸光值。用直線回歸方程計(jì)算樣品淀粉酶的活性。2 活性計(jì)算酶活力單位定義：在60、PH5.6條件下，每小時(shí)從2的可溶性淀粉溶液中釋放出1mg爾麥芽糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）淀粉酶活性U按下式計(jì)算： K×（AA0） S×（30÷60）×180 U = ×F其中：U樣品淀粉酶活性，U/ml； K標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；F樣品溶液反應(yīng)前的總量，ml；S樣品測試量；表1中S1ml；601小時(shí)為60min；30反應(yīng)時(shí)間，min。試劑 (1)2% 淀粉溶液 (2) 0.4mol/L 氫氧化鈉 (3) pH5.6 檸檬酸緩沖液 稱取檸檬酸 20.01g ，溶解后定容至 1000mL ，為 A 液。稱取檸檬酸鈉 29.41g ，溶解后定容至 1000mL ，為 B 液。取 A 液 13.7mL 與 B 液 26.3mL 混勻，即為 pH5.6 之緩沖液。 (4) 3,5- 二硝基水楊酸 精確稱