Western印跡技術詳解

1、Western印跡印跡實驗目的實驗目的實驗原理實驗原理 Western印跡雜交法是利用特異性抗體做探針，對附著于固相支持體上的某些特異性蛋白進行鑒別和定量的方法。它具有固相操作簡便及不必對細胞進行放射性預標記等優(yōu)點。原理為：將待測樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白變性并分離，用電轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移到固相支持體上（NC膜、PVDF膜），濾膜與抗靶蛋白的非標記抗體反應，再用二級免疫學試劑進行檢測。檢測方法有放射性標記、酶標化學顯色或酶標化學發(fā)光等。酶標化學發(fā)光法以其高敏感性、結(jié)果可在X光片上長期保存等優(yōu)點而優(yōu)于酶標化學顯色法。 是蛋白水平檢測，研究基因表達與功能的一種方

2、法。是蛋白水平檢測，研究基因表達與功能的一種方法。 原理及步驟原理及步驟 T or cell 提取蛋白提取蛋白 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白（聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白（SDS-PAGE ) 轉(zhuǎn)移（印跡）于硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移（印跡）于硝酸纖維素膜 加抗體檢測某種特異性蛋白質(zhì)加抗體檢測某種特異性蛋白質(zhì)Western Blot 實驗材料實驗材料129:1聚丙烯酰胺凝膠2Tris-甘氨酸電泳緩沖液：25mM Tris 堿250mM 甘氨酸0.1%(m/v) SDS31SDS凝膠加樣緩沖液： 50mmol/L Tris-Cl (pH6.8) 100 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT） 2% (m/v)

3、 SDS 0.1% (m/v) 溴酚藍10% 甘油臨用前加DTT，DTT可用0.01M 乙酸鈉（pH5.2）配成1mmol/L母液。4轉(zhuǎn)移緩沖液：25mM Tris 堿193mM 甘氨酸20% 甲醇51TBS：20mM Tris-HCl 150mM NaCl 最后調(diào)pH值至7.4 6TBST: TBS中加入0.05% Tween-20。7封閉液：用TBST配制5%脫脂奶粉。8Stripping Buffer：100mM 巰基乙醇2%(m/v) SDS62.5mM Tris-HCl最后調(diào)pH值至6.7方法和步驟一配膠注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的

4、紙巾晾干。分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.70.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度。灌入2/3的分離膠后應立即封膠，膠濃度10%時可用0.1%的SDS封，濃度10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.

5、1%的SDS。封膠后切記，勿動。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻控凈。灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正；若變形嚴重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內(nèi)部分子的排列尚未完成。 二樣品處理二樣品處理1培養(yǎng)的細胞（定性）：

6、 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。 對于6孔板來說每孔加200300l，6080的1loading buffer。 100，1min。 用細胞刮刀刮下細胞后在EP管中煮沸10min。 用干凈的針尖挑絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0后在400016000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。 待樣品恢復到室溫后上樣。2培養(yǎng)的細胞（定量）： 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。 加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上1020

7、min。 用細胞刮刀刮下細胞，收集在EP管后超聲（100200w）3s，2次。 12000g離心，4，2min。 取少量上清進行定量。 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲存，-70一個月，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。3組織： 勻漿：對于心肝脾腎等組織可每50100mg加1ml裂解液，肺100200mg加1ml裂解液?？墒謩踊螂妱觿驖{。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 12000g離心，4，2min。 取少量上清進行定量。 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加load

8、ing buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲存，-70一個月，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。 三電泳三電泳1上樣前將膠板下的氣泡趕走。2所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1loading buffer上樣，Marker也用1loading buffer調(diào)整至與樣品等體積。3. 以初始電壓為45V時的電流強度進行穩(wěn)流電泳，當電壓達65V時改為穩(wěn)壓電泳。4. 在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結(jié)束。 四轉(zhuǎn)膜四轉(zhuǎn)膜1電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開始準備：浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細作用自然吸水后

9、再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。2取膠：將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按“濾紙凝膠NC膜濾紙”（從上到下）的順序裝置好。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路）3轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或

10、400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時。負載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。 五封閉及雜交五封閉及雜交1封閉：將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與TBST稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。2結(jié)合一抗：一抗的準備：使用反貼法時每張39cm2膜約需2ml一抗稀釋液。反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出

11、，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4靜置過夜。在反應體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。3洗滌：一抗孵育結(jié)束后，用TBST漂洗膜后再浸洗四次，每次10min。4結(jié)合二抗：根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標記的抗體，按相應比例稀釋（1:10001:10000），室溫輕搖一小時。5洗滌：二抗孵育結(jié)束后，用TBST漂洗膜后再浸洗六次，每次10min。 六發(fā)光鑒定六發(fā)光鑒定一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。1HRP-ECL發(fā)光法：將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，

12、濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。2AP-NBT/BICP顯色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個 EP管中，每張39cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色20s后每

13、10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。 七膜再生七膜再生 如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置差別較大則只需用TBST洗滌掉發(fā)光液（10min3次）后從一抗雜交開始，后續(xù)步驟同前。 如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置較近則需更強的洗滌，可用 strip液（可用雜交袋）于室溫搖動洗滌30min60min，然后用TBST洗滌10min3次，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。 對于雜交若干次的膜，如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強度更強的自配的strip液（可用雜交袋）于50洗滌30min，然后用TBST洗滌10min3次

14、，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。 四、注意事項四、注意事項內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。其作用是校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準確性。 在Western Blotting中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達，由于內(nèi)參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整

15、個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下蛋白含量不會發(fā)生改變的蛋白作內(nèi)參。1. 為了讓實驗更加嚴謹有說服力都要設計對照實驗，對照分為：陽 性對照（最好有標準品（比如-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性 對照（測血時用相應小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關對照（用無關抗體）2. 一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當?shù)谋壤?，一抗二抗的選擇直接影響實驗結(jié)果以及背景的深淺。3. 實驗設計時所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來個體差異。特別在做裂解液時更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實驗帶來不確定性。4. 凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實驗結(jié)果，要特別注意幾點：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點樣孔平整。5. 電泳、轉(zhuǎn)膜時特別要注意正負極，電壓電流都不能過高；轉(zhuǎn)膜時“三明治”的疊放次序不錯，同時要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉(zhuǎn)溫度保持在