氡暴露對(duì)大鼠氣管

1、氡暴露對(duì)大鼠氣管 在人類(lèi)生活環(huán)境的天然本底輻射中，由于吸入氡及其子體所產(chǎn)生的輻射劑量約占54%，氡暴露導(dǎo)致的健康危害，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞是研究氡暴露生物效應(yīng)的良好模型，但由于受到染毒裝置等條件的限制，過(guò)去多進(jìn)行體外研究。本實(shí)驗(yàn)利用多功能移動(dòng)式氡室對(duì)大鼠動(dòng)態(tài)吸入染毒，利用建立的動(dòng)物模型，采用消化后刷洗法分離得到大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞1，觀察氡染毒后靶細(xì)胞體外發(fā)生轉(zhuǎn)化的過(guò)程，探討氡暴露對(duì)細(xì)胞的損傷效應(yīng)。1 材料與方法11 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 實(shí)驗(yàn)用Wistar雄性大鼠，78周齡(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003。采用自制HD-3型

2、多功能移動(dòng)式氡室，對(duì)大鼠動(dòng)態(tài)吸入染毒。按照氡染毒的累計(jì)暴露量，分為60，90，120工作月(Working Level Month,WLM)和對(duì)照組共4組，每組6只動(dòng)物。染毒時(shí)間每天8h，每周6d，染毒期間動(dòng)物自由活動(dòng)飲食。12 選擇性培養(yǎng)基制備 選擇性F12培養(yǎng)基為Hams F12培養(yǎng)基，含有2%胎牛血清，5mg/L胰島素，03 mol/L氫化可的松。13 氣管-支氣管上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)采用本實(shí)驗(yàn)室建立的消化后刷洗法，見(jiàn)文獻(xiàn)1。14 細(xì)胞集落形成率 收集大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以1105個(gè)/60mm培養(yǎng)皿接種于無(wú)血清完全F

3、12培養(yǎng)基中375%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，78d后計(jì)數(shù)其形成的細(xì)胞集落數(shù)，并根據(jù)接種的細(xì)胞量計(jì)算細(xì)胞集落形成率(CFE)。一個(gè)細(xì)胞集落的標(biāo)準(zhǔn)是含有15個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞團(tuán)，CFE=細(xì)胞集落數(shù)/ ( 氡暴露對(duì)大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化影響 ) 接種的細(xì)胞量100%。15 細(xì)胞存活率 根據(jù)CFE得出的結(jié)果，計(jì)算出大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞存活率。其計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率=氡暴露組細(xì)胞集落形成率/對(duì)照組細(xì)胞集落形成率100%。16 轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選 上述細(xì)胞集落計(jì)數(shù)后，即轉(zhuǎn)入選擇性F12培養(yǎng)基對(duì)氣管-支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行篩選。4d換液1次，選擇性培養(yǎng)5周，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率(TF)，TF=轉(zhuǎn)化細(xì)胞集

4、落數(shù)/進(jìn)入選擇的細(xì)胞集落數(shù)100%。17 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立 大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)5周后，根據(jù)Kitamural2報(bào)道的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞小而密集的或型集落是具有轉(zhuǎn)化趨向的集落，倒置顯微鏡下鑒定后，用消毒棉簽除去其他的集落細(xì)胞，使每皿只含有一個(gè)轉(zhuǎn)化集落，繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)或型集落擴(kuò)增，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2 結(jié)果21 氡染毒對(duì)大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響(表1) 隨著氡暴露累積劑量的增加，大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞的集落形成率相應(yīng)下降(圖1，r=-098,P0.01)，而轉(zhuǎn)化率則隨之增加，呈一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。當(dāng)暴露量達(dá)到90WLM時(shí)，無(wú)論集落形成率還是轉(zhuǎn)化率，與對(duì)照

5、組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P001。表1 氡暴露對(duì)大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（略）注：與對(duì)照組比較，*P001圖1 大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞集落形成率和轉(zhuǎn)化率與氡累積暴露量的關(guān)系（略）22 氡染毒對(duì)大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞存活的影響 隨著氡暴露累積劑量的增加，大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞的存活率相應(yīng)下降，60WLM組為(882109)%，90WLM組為(71589)%，120WL組為(607115)%。23 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 從累積暴露量為90WLM組動(dòng)物得到的1個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落連續(xù)傳代12代，從120WLM組動(dòng)物得到的1個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落連續(xù)傳代16代后，這2個(gè)細(xì)胞系均出現(xiàn)明顯衰老現(xiàn)象，并生長(zhǎng)緩慢，

6、然后終止傳代，分別收集細(xì)胞，冷凍保存，用于后續(xù)相關(guān)研究。3 討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著氡暴露累積劑量的增加，大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞的集落形成率和存活率相應(yīng)下降，并呈一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。表明氡染毒后大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)早期轉(zhuǎn)化集落中的或型集落擴(kuò)增后傳代培養(yǎng)，得到2個(gè)連續(xù)傳代的非致瘤細(xì)胞系，分別傳代12和6代。但這2個(gè)細(xì)胞系因明顯的衰老跡象而終止傳代，未能進(jìn)行軟瓊脂集落形成和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)化是細(xì)胞建系過(guò)程中重要的一步，是建立永生細(xì)胞系的基礎(chǔ)，可為研究氡致肺癌提供一個(gè)直接的途徑。細(xì)胞轉(zhuǎn)化是少數(shù)細(xì)胞異常增殖的結(jié)果，而這種異常增殖與癌基因的激活和抑癌基因的失活

7、密切相關(guān)3。粒子是否通過(guò)影響這兩類(lèi)基因而引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化甚至惡性轉(zhuǎn)化，有待進(jìn)一步研究。? ) 靜慰嘉南住?/STRONG1 崔鳳梅，蘇世標(biāo)，聶繼華，等.大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞的分離、鑒定和培養(yǎng)J.中國(guó)輻射衛(wèi)生，2005，14(4)：246-247.2 Kitamural H,Fitzgerald DJ,Li LA,et al.Morphological characterization of transformed colonies in rat tracheal epithelial cell cultures exposed to carcinogensJ.Cancer Research,19