愈合期與正常內(nèi)側(cè)副韌帶細胞生物學(xué)特性差別比較的實驗研究

1、    愈合期與正常內(nèi)側(cè)副韌帶細胞生物學(xué)特性差別比較的實驗研究             作者：姜大朋，李昭鑄，張玉波，蔣志濤【摘要】【關(guān)鍵詞】  膝內(nèi)側(cè)副韌帶； 成纖維細胞； 平滑肌肌動蛋白； 細胞增殖    Abstract：ObjectiveTo examine the difference of proliferation and smooth muscle actin(SMA) expre

2、ssion between healing and normal medial collateral ligament (MCL) fibroblasts.MethodTen adult,male,SpragueDawley rats weighing between 350 and 375 g were used in this study.Normal and healing MCL were cut into small pieces in aseptic conditions,and then placed and cultured in culture chamber.Fibrobl

3、asts were passaged with 0.25% trypsin.After 24 and 48 hours incubation,MTT was used to measure the cell proliferation.The production  of SMA was measured by Western Blot.ResultAfter 24 and 48 hours incubation,healing fib roblasts showed absorbency values of 0.49±0.080 and 0.53±0.07 re

4、spectively.II was found that healing fibroblasts proliferated faster than normal fibroblasts (P<0.05).Healing fibroblasts had 1.7 fold greater protein expression of aSMA than normal fibroblasts (P<0.05).ConclusionHealing fibroblasts possess a faster proliferation and higher aSMA protein expres

5、sion than normal fibroblasts.The findings provide a cellular and molecular basis for realizing the mechanism and improving the quality of healing process.    Key words：knee medial collateral ligament;  fibroblast;  smooth muscle actin;  cell proliferation  

6、60; 隨著人們參加體育運動的增加，內(nèi)側(cè)副韌帶(medial collateral ligament，MCL)損傷的發(fā)生率逐年增加。MCL愈合后組織學(xué)、生物化學(xué)及生物力學(xué)特性均有所改變，愈合后不能恢復(fù)正常韌帶的強度和彈性，受牽拉后容易再次斷裂1，2。成纖維細胞在損傷韌帶修復(fù)重建過程中發(fā)揮著重要的作用。正常韌帶與愈合期韌帶成纖維細胞的生物學(xué)特性可能存在著差別3。深入探討這種差別可以為認(rèn)識韌帶損傷愈合的細胞及分子機制提供理論依據(jù)，并可以為提高韌帶愈合質(zhì)量提供新的治療策略。本實驗對愈合期MCL成纖維細胞增殖及平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)表達能力與正常韌帶成纖維細胞

7、作了系統(tǒng)的比較。    1  材料和方法    1.1  試劑    DMEM(美國GIBCO公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT、DMSO(美國Sigma公司)，小鼠抗SMA單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗actin單克隆抗體(美國Santa Cruz)，RIPA蛋白裂解液、BCIPNBT底物顯色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)，GIS數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，酶標(biāo)儀(Reader，日本)。其余

8、有關(guān)分子生物學(xué)試劑由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中心實驗室提供。    1.2  MCL細胞培養(yǎng)    參照Agarwai4的方法，選取成年雄性SD大鼠12只(體重350375 g)，用1戊巴比妥鈉(40 mgkg)腹腔內(nèi)注射麻醉，雙膝部剃毛、消毒，于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)作1 cm長的縱切口，將MCL暴露，實驗組用手術(shù)刀片將左側(cè)MCL在脛骨結(jié)節(jié)水平橫斷，橫斷處形成一約2 mm寬的縫隙，斷端處以黑色絲線打結(jié)作為標(biāo)記，然后以5-0可吸收線縫合皮膚。對照組暴露右側(cè)MCL后即縫合皮膚。手術(shù)后將大鼠重新投入各自籠中飼養(yǎng)。至術(shù)后第10 d，將膝關(guān)節(jié)

9、處正常韌帶與愈合韌帶取下，根據(jù)手術(shù)時黑色絲線結(jié)節(jié)標(biāo)記及愈合處韌帶局部增粗來判斷韌帶愈合處肉芽組織，將該愈合部位韌帶剪下作細胞培養(yǎng)。對照組(假手術(shù)組)則在相當(dāng)于實驗組取材部位剪下約2 mm的一段作細胞培養(yǎng)。無菌切取的MCL放入含100 uml PG和100 gml SM雙抗Hank's液中，反復(fù)沖洗并用解剖刀去除韌帶外周組織，以眼科剪剪成1 mm3大小，并將其置于培養(yǎng)瓶中，將組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底上，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令瓶底向上，置于37含5CO2、95空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)4 h，然后取出培養(yǎng)瓶，加含15胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液后再緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，置培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，待細胞從組織塊爬出，

10、再補加DMEM培養(yǎng)液。待細胞生長成單層后，以胰蛋白酶消化傳代。    1.3  MTT法測定韌帶細胞增殖    收獲第3代的MCL細胞，以2.5×104細胞孔的濃度，接種于96孔培養(yǎng)板上，每組4個復(fù)孔。CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48 h后，每孔入MTT溶液(5 mgml)20 l，在37、5CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。然后每孔加入150 l DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值(波長490 nm)。    1.

11、4  WesternBlot檢測SMA表達    收集兩組細胞，加入RIPA細胞裂解緩沖液裂解細胞，冰浴20 min，4 3 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。取等量的(5 g)細胞總蛋白按常規(guī)方法進行12聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)變性電泳，繼之20 mA恒流半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5脫脂奶粉于4封閉過夜，TBST洗滌液洗膜4次，每次5 min。加入小鼠抗SMA單克隆抗體(1250)，37孵育1 h，洗膜。加入堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG(1750)，洗膜后以BCIPNBT底物顯色試劑盒顯色，天

12、能凝膠成象分析系統(tǒng)掃描條帶并分析。以actin作為內(nèi)參，計算相對值。實驗重復(fù)3次。    1.5  統(tǒng)計方法    采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用配對t檢驗。P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。    2  結(jié)  果    2.1  愈合期韌帶與正常韌帶成纖維細胞增殖差別    如表1所示，愈合期韌帶與正常韌帶細胞增殖存

13、在明顯的差別。經(jīng)過24、48 h的培養(yǎng)，愈合期韌帶細胞增殖的速率均明顯高于正常韌帶細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表1  愈合期韌帶與正常韌帶成纖維細胞的增殖說明：24、48 h時愈合期韌帶與正常韌帶成纖維細胞的增殖均具有顯著性差異(P<0.05)。    2.2  愈合期韌帶與正常韌帶成纖維細胞SMA表達的差別    Western Blot結(jié)果顯示，愈合期韌帶細胞SMA表達量明顯高于正常韌帶細胞。半定量分析提示，愈合期韌帶細胞SMA表達量是正常韌帶細胞的1.7倍(圖1)，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P

14、<0.05)。    圖1  愈合期韌帶與正常韌帶成纖維細胞SMA的表達  *P<0.05，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義    3  討  論    隨著人們體育運動的增加，MCL損傷在肌肉骨骼系統(tǒng)病變中所占的比例亦逐年增高。輕度的MCL損傷可以自愈，不需要外科處置，但自愈后的MCL在組織學(xué)、生物化學(xué)、生物力學(xué)特性等方面均有所改變，表現(xiàn)為：膠原排列紊亂、膠原交叉結(jié)合減少、膠原纖維變細及減少、膠原成分改變，愈合后韌帶的抗拉力減低2，5。由于正常韌帶細胞與愈

15、合期韌帶細胞存在于不同的內(nèi)環(huán)境，正常韌帶細胞僅維持韌帶基質(zhì)成分的穩(wěn)定，而愈合期韌帶細胞在損傷后修復(fù)重建過程中發(fā)揮著重要的作用4，其生物學(xué)特性必然存在著差異。    組織損傷后，局部細胞增殖移行能力增強，以此來達到組織修復(fù)的目的，韌帶愈合過程亦是如此。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過48 h的培養(yǎng)，愈合期韌帶細胞較正常韌帶細胞增殖速率快。細胞增殖能力的增強有利于韌帶的修復(fù)，但增殖細胞的生物學(xué)特性對愈合后韌帶的結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)特性有著密切的關(guān)系。通常，損傷后組織愈合時多表現(xiàn)為過度收縮，而這種過度收縮是由損傷部位大量表達SMA的肌成纖維細胞導(dǎo)致，最終誘發(fā)瘢痕的形成，這對愈合后韌帶的結(jié)

16、構(gòu)及生物力學(xué)特性必將產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。肌成纖維細胞由愈合過程中成纖維細胞轉(zhuǎn)分化而來，其一定程度的收縮對于傷口的閉合是必需的，但過度收縮則可導(dǎo)致愈合組織瘢痕的形成6。本實驗發(fā)現(xiàn)，愈合韌帶成纖維細胞SMA表達明顯高于正常韌帶細胞，SMA是肌成纖維細胞的標(biāo)志物7。由于本實驗中每孔的蛋白上樣量均一致，所以兩組間細胞數(shù)的差別不影響蛋白印跡的結(jié)果。肌成纖維細胞多出現(xiàn)在組織損傷后46 d，它的活性可保持到損傷后23周。Agarwal4等曾提出利用RNA干擾技術(shù)下周愈合期韌帶細胞SMA的表達可能是減弱成纖維細胞過度收縮的有效方法，從而可以減輕韌帶愈合后瘢痕產(chǎn)生并改善愈合后的生物學(xué)功能。  &

17、#160; 本實驗發(fā)現(xiàn)，即使細胞被傳代至第3代，兩組間差別依然顯著，這種差別在體內(nèi)可能維持更長的時間。因此，應(yīng)采取必要的措施對愈合期韌帶細胞的生物學(xué)行為進行調(diào)控。實驗中考慮到手術(shù)操作時皮膚切開等可能會影響MCL成纖維細胞，本實驗利用假手術(shù)組作為對照，這樣可以將韌帶橫斷以外的手術(shù)操作影響因素排除。另外，取愈合10 d的韌帶組織是由于此時韌帶成纖維細胞正處于增殖活躍的階段3。實驗中僅觀察了部分時間點的差別，將來的實驗應(yīng)對愈合韌帶與正常韌帶細胞的差別作動態(tài)觀察。    總之，本實驗發(fā)現(xiàn)愈合韌帶細胞增殖及SMA表達能力明顯較正常韌帶細胞強，這為了解韌帶愈合過程以及如何能提

18、高韌帶愈合質(zhì)量在細胞及分子水平提供了充分的理論基礎(chǔ)。 【參考文獻】  1 姜大朋，李昭鑄.膝部韌帶損傷愈合機制及其組織工程學(xué)治療進展J.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2006,10: 941-943.2 Liang R,Woo SL,Takakura Y, et al Longterm effects of porcine small intestine submucosa on the healing of medial collateral ligament: a functional tissue engineering studyJ.J Orthop Res,2006,4:811-819.3 Kydd AS,Achari Y,Lu T, et al The healing rabbit medial collateral ligament of the knee responds to systemically administered glucocorticoids differently than the uninjured tissues of the same joint or the uninjured MCL: a paradoxical shift in impact on specifi