生物化學實驗

1、生物化學實驗細則 為了保證生物化學實驗的順利進行， 培養(yǎng)同學們掌握良好、 規(guī)范的生物化學基本實驗技能， 特制定以下實驗細則，請同學們嚴格遵守。 1. 實驗前應提前預習實驗指導書并復習相關知識。 2. 嚴格按照生物化學實驗分組，分批進入實驗室，不得遲到。非本實驗組的同學不準進入實驗室。 3. 進入實驗室必須穿實驗服。各位同學進入各自實驗小組實驗臺后，保持安靜，不得大聲喧嘩和嬉戲，不得無故離開本實驗臺隨便走動。絕對禁止用實驗儀器或藥物嬉耍。 4. 實驗中應保持實驗臺的整潔，廢液倒入廢液桶中，用過的濾紙放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或隨地亂丟。 5. 實驗中要注意節(jié)約藥品與試劑，愛護儀器，使用前應

2、了解使用方法，使用時要嚴格遵守操作規(guī)程，不得擅自移動實驗儀器。否則，因非實驗性損壞，由損壞者賠還。 6. 使用水、火、電時，要做到人在使用，人走關水、斷電、熄火。 7. 做完實驗要清洗儀器、器皿，并放回原位，擦凈桌面。 8. 實驗后，要及時完成實驗報告。實驗記錄和實驗報告一、 實驗記錄實驗課前應認真預習，將實驗名稱、目的和要求、原理、實驗內容、操作方法和步驟等簡單扼要地寫在記錄本上。實驗中觀察到的現(xiàn)象、結果和數(shù)據(jù)，應該及時地直接記在記錄本上，絕對不可以用單片紙做記錄或草稿。原始記錄必須準確、簡練、詳盡、清楚。從實驗課開始就應養(yǎng)成這種良好的習慣。記錄時，應做到正確記錄實驗結果、切忌夾雜主觀因素，

3、這是十分重要的。在實驗條件下觀察到的現(xiàn)象，應如實仔細地記錄下來。在定量實驗中觀測的數(shù)據(jù)，如稱量物的重量、滴定管的讀數(shù)、光電比色計或分光光度計的讀數(shù)等，都應設計一定的表格準確記下正確的讀數(shù)，并根據(jù)儀器的精確度準確記錄有效數(shù)字。例如，光密度值為0.050不應寫成0.05。每一個結果最少要重復觀測兩次以上，當符合實驗要求并確知儀器工作正常后再寫在記錄本上。實驗記錄上的每一個數(shù)字，都是反映每一次實驗的測量結果，所以，重復觀測時即使數(shù)據(jù)完全相同也應如實記錄下來。數(shù)據(jù)的計算也應該寫在記錄本的另一頁上，一般寫在正式記錄左邊的一頁。總之，實驗的每個結果都應正確無遺漏地做好記錄。實驗中使用儀器的類型、編號以及試

4、劑的規(guī)格、化學式、分子量、準確的濃度等，都應記錄清楚，以便總結實驗時進行核對和作為查找成敗原因的參考依據(jù)。如果發(fā)現(xiàn)記錄的結果有懷疑、遺漏、丟失等，都必須重做實驗。因為，將不可靠的結果當作正確的記錄，在實際工作中可能造成難于估計的損失。所以，在學習期間就應一絲不茍，努力培養(yǎng)嚴謹?shù)目茖W作風。二、 實驗報告實驗結束后，應及時整理總結實驗結果，寫出實驗報告。實驗報告的書寫應使用黑色或藍色鋼筆或圓珠筆，可使用鉛筆作圖或用Excel電腦打印制作標準曲線。 在實驗報告中，目的和要求、原理以及操作方法部分應簡單扼要的敘述，但是對于實驗條件（試劑配制及儀器）和操作的關鍵環(huán)節(jié)必須寫清楚。對于實驗結果部分，應根據(jù)實

5、驗課的要求將一定實驗條件下獲得的實驗結果和數(shù)據(jù)進行整理、歸納、分析和對比，并盡量總結成各種圖表，如原始數(shù)據(jù)及其處理的表格、標準曲線圖以及比較實驗組與對照組實驗結果的圖表等。另外，還應針對實驗結果進行必要的說明和分析。討論部分可以包括：思考題；實驗的正常結果和異常現(xiàn)象；關于實驗方法（或操作技術）和有關實驗的一些問題；對于實驗設計的認識、體會和建議；對實驗課的改進意見等（要針對實驗操作方面內容，對于應付寫缺少儀器設備的不給分）。實驗報告規(guī)范格式：一、實驗目的：5分二、實驗原理: 15分三、實驗步驟: 20分四、實驗結果: 20分五、討論分析: 30分六、改進實驗建議: 10分1糖類的顏色反應目的：

6、應用糖的顏色反應鑒別糖類內容：Molisch反應、Seliwanoff反應2總糖和還原糖含量的測定目的：掌握樣品中還原糖和總糖的提取和測定方法內容：總糖和還原糖的測定3總氮量的測定（凱氏定氮法）目的：掌握總氮含量測定的原理和技術內容：凱氏定氮法測定總氮4.Bradford法測定蛋白質濃度目的：掌握蛋白質濃度測定的原理和方法內容：Bradford法測定蛋白質濃度5氨基酸的分離鑒定（紙層析法）目的：掌握氨基酸的性質，紙層析法的基本原理及操作方法內容:氨基酸的紙層析6蛋白質的沉淀反應和等電點的測定目的：了解蛋白質的兩性解離性質內容：蛋白質沉淀，等電點測定7肝細胞核中核酸的分離和測定目的：掌握核酸的分

7、離和測定方法內容：從肝細胞中分離核酸（DNA和RNA），并測定其含量8維生素C的定量測定目的：掌握維生素C的測定原理和方法內容：2,4-二硝基苯肼法測定維生素C9血液中轉氨酶活性分析分光光度法目的：了解轉氨酶的性質及臨床意義。掌握谷丙轉氨酶活力的測定方法。內容：酶活力測定10脂肪酸的-氧化目的：掌握脂肪酸的-氧化的過程及產(chǎn)物內容：脂肪酸-氧化的檢測方法11蛋白質相對分子質量的測定目的：學會獨立設計實驗策略、摸索和設計樣品處理等操作細節(jié)，并通過獨立思考分析結果。內容：學生自行設計實驗，在給定實驗目的的前提下，使學生能夠自行設計實驗，掌握一種測定未知蛋白質的分子量的方法； 實驗一 糖類的顏色反應一

8、、實驗目的1了解糖類某些顏色反應的原理。2學習應用糖的顏色反應鑒別糖類的方法。二、實驗原理1.-萘酚反應（Molisch反應）原理糖在濃無機酸（硫酸、鹽酸）作用下，脫水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能與-萘酚生成紫紅色物質。因為糠醛及糠醛衍生物對此反應均呈陽性，故此反應不是糖類的特異反應。2.間苯二酚反應（Seliwanoff反應）原理在酸作用下，酮糖脫水生成羥甲基糠醛，后者再與間苯二酚作用生成紅色物質。此反應是酮糖的特異反應。醛糖在同樣條件下呈色反應緩慢，只有在糖濃度較高或煮沸時間較長時，才呈微弱的陽性反應。在實驗條件下蔗糖有可能水解而呈陽性反應。三、器材1.試管及試管架 2.滴管3.水浴鍋四、

9、試劑1.莫氏（Molisch）試劑： 5% -萘酚的酒精溶液，稱取-萘酚5g，溶于95%酒精中，并用此酒精使總體積達100mL，貯于棕色瓶內。此試劑需新鮮配制。2.塞氏（Seliwanoff）試劑：稱取間苯二酚0.05g溶于30 mL濃鹽酸中，再用蒸餾水稀釋至100 mL，此試劑需新鮮配制。3.1%葡萄糖溶液：稱取葡萄糖1g，溶于100mL蒸餾水中。4.1%果糖溶液：稱取果糖1g，溶于100mL蒸餾水中。5.1%蔗糖溶液：稱取蔗糖1g，溶于100mL蒸餾水中。6.1%淀粉溶液：稱取可溶性淀粉1g與少量冷蒸餾水混合成薄漿狀物，然后緩緩傾入沸蒸餾水中，邊加邊攪，最后以沸蒸餾水稀釋至100mL。7.

10、0.1%糠醛溶液：稱取糠醛0.1g，溶于100mL蒸餾水中。8.濃硫酸 500mL五、操作1.-萘酚反應（Molisch反應）取5支試管，分別加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、0.1%糠醛溶液各1.5mL。再向5支試管中各加入2滴莫氏試劑，充分混合。斜執(zhí)試管，沿管壁慢慢加入濃硫酸約1mL，慢慢立起試管，切勿搖動。濃硫酸在試液下形成兩層。在二液分界處有紫紅色環(huán)出現(xiàn)。觀察、記錄各管顏色。試劑現(xiàn)象解釋現(xiàn)象1%葡萄糖溶液1%果糖溶液1%蔗糖溶液1%淀粉溶液0.1%糠醛溶液2.間苯二酚反應（Seliwanoff反應）取3支試管，分別加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶

11、液各5mL。再向各管分別加入塞氏試劑2mL，混勻。將3支試管同時放入沸水浴中，注意觀察、記錄各管顏色的變化及變化時間。六、思考題1可用何種顏色反應鑒別酮糖的存在？2-萘酚反應的原理是什么？實驗二 還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法一、目的與要求掌握還原糖和總糖測定的基本原理，學習比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計的使用。二、實驗原理還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，如乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，

12、可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540 nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。三、實驗材料、主要儀器和試劑1實驗材料 小麥面粉(1000 g) 2主要儀器（1）具塞玻璃刻度試管：20 mL11 （2） 濾紙 （3

13、）燒杯：100 mL2 （4）三角瓶：100 mL1 （5）容量瓶：100 mL3 （6）刻度吸管：1mL1；2 mL2；10 mL1 （7）恒溫水浴鍋 （8）煤氣爐 （9）漏斗 （10）天平 （11）分光光度計3 試劑（1）1mg/mL葡萄糖標準液準確稱取80 烘至恒重的分析純葡萄糖100 mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉移到100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，混勻，4冰箱中保存?zhèn)溆谩?（2）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.5 g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L氫氧化鈉溶液32

14、5 mL，再加入45 g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化鉀溶液：稱取5 g碘和10 g碘化鉀，溶于100 mL蒸餾水中。（4）酚酞指示劑：稱取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。（5） 6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分別取59.19 mL 37%濃鹽酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步驟1. 制作葡萄糖標準曲線取7支20 mL具塞刻度試管編號，按表1分別加入濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應液。表1 葡萄糖標準曲線制作管 號1mg/mL葡萄糖標準液（mL）

15、蒸餾水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值 （OD540nm）0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2將各管搖勻，在沸水浴中準確加熱5 min，取出，用冷水迅速冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20 mL，加塞后顛倒混勻。調分光光度計波長至540 nm，用0號管調零點，等后面710號管準備好后，測出16號管的光密度值。以光密度值為縱坐標，葡萄糖含量（mg）為橫坐標，在坐標紙上繪出標準曲線。 葡萄糖標準曲線光密度值葡萄糖含量（mg）2. 樣品中還原糖和總糖的測定（

16、1）還原糖的提取準確稱取3.00 g食用面粉，放入100 mL燒杯中，先用少量蒸餾水調成糊狀，然后加入50 mL蒸餾水，攪勻，置于50 恒溫水浴中保溫20 min，不時攪拌，使還原糖浸出。過濾，將濾液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。（2）總糖的水解和提取準確稱取1.00 g食用面粉，放入100 mL三角瓶中，加15 mL蒸餾水及10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加熱水解30 min, 取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍色。水解畢。冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6 mol/L NaOH溶液中和至溶液

17、呈微紅色，并定容到100 mL，過濾取濾液10 mL于100 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測定。（3）顯色和比色取4支20 mL具塞刻度試管，編號，按表2所示分別加入待測液和顯色劑，將各管搖勻，在沸水浴中準確加熱5 min，取出，冷水迅速冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20 mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進行比色。調波長540 nm，用0號管調零點，測出710號管的光密度值。表2 樣品還原糖測定管 號還原糖待測液（mL）總糖待測液（mL）蒸餾水（mL）DNS（mL）光密度值（OD540nm）查曲線葡萄糖量（mg）平均值70.51.51.580.51.

18、51.59111.510111.5五、結果與計算計算出7、8號管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在標準曲線上分別查出相應的葡萄糖毫克數(shù)，按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量(以葡萄糖計)。還原糖（%）=查曲線所得葡萄糖毫克數(shù) 提取液總體積測定時取用體積100 =樣品毫克數(shù)總糖（%）=查曲線所得水解后葡萄糖毫克數(shù)稀釋倍數(shù)0.9100 =樣品毫克數(shù)六、注意1. 標準曲線制作與樣品測定應同時進行顯色，并使用同一空白調零點和比色。2. 面粉中還原糖含量較少，計算總糖時可將其合并入多糖一起考慮。七、思考題1.在樣品的總糖提取時，為什么要用濃HCl處理？而在其測定前，又為何要用NaOH中

19、和？2.標準葡萄糖濃度梯度和樣品含糖量的測定為什么應該同步進行？比色時設0號管有什么意義？3. 繪制標準曲線的目的是什么？實驗三 動物組織中核酸的分離及定量核酸廣泛的存在于一切生物細胞中，亦為病毒的主要成分。業(yè)已證實核酸在蛋白質的生物合成，病毒的傳染、癌瘤的發(fā)生以及生物遺傳等方面均有重要作用，引起科學界對核酸研究的重視。本實驗通過生物材料中核酸的分離及定量使學生初步了解RNA和DNA的基本測定方法，對生物學及醫(yī)學的研究具有一次意義。核酸基本組成單位是核苷酸類，即由有機含氮堿、戊糖及磷酸所構成，作為RNA核苷酸成分的特點是含有核糖，而DNA則含脫氧核糖，此外有機堿可有所不同，如RNA含尿嘧啶，而

20、DNA含胸腺嘧啶等?！緦嶒災康摹空莆蘸怂岱蛛x定量的原理和方法【實驗原理】根據(jù)核酸與組織其它有機物質在溶劑中溶解性的不同，而逐步使之與脂類，蛋白質以及其它小分子物質分離。然后根據(jù)兩種核酸所含戊糖的性質分別進行定量。（l）除去低分子物質： 用三氯乙酸將細胞中的高分子物質，如蛋白質及脂類（呈脂蛋白形式存在）沉淀下來，而使一些小分子物質溶于三氯乙酸中，離心進行分離。（2）除去脂類：用熱乙醇提取沉淀中脂類。（3）提取核酸及定量。向沉淀（只含有核酸及蛋白質）中加三氯乙酸，并在90加熱，使核酸水解為其組成成分而溶于酸，這時蛋白質不受影響，離心后將核酸的水解產(chǎn)物（在上清中）與蛋白質（沉淀部分）分開，取上清以二

21、苯胺或地衣酚試劑呈色。可分別測定DNA及RNA的量。呈色的基本原理是當RNA中的核糖及DNA中的脫氧核糖在酸的存在下加熱時則脫水生成醛類衍生物并分別同地衣酚（35一二羥基甲苯，或二本胺試劑反應產(chǎn)生呈色物質。 【實驗操作】（1）取新鮮鼠肝 0.4g，用小剪刀剪碎，放勻漿管中，用吸管取 15三氯乙酸 8mL，先加約23mL于上述勻漿管中，用勻漿器研磨35分鐘。然后移入一離心管中（注意在轉移過程中避免損失），再以 15三氯醋酸2mL洗勻漿管，重復洗 23次，注意將勻漿管洗凈，全部移入離心管中此時總量約8mL靜止5分鐘后離心10分鐘（3000rpm）（2）傾棄上清（用玻璃輕棒管口，迅速傾泄之）。（3）

22、在離心管中加入8mL無水乙醇（醋酸鈉飽和的）。用玻璃棒攪起沉淀。（4）準備好一沸騰水浴，將火關閉（注意：此項操作要嚴格遵守，否則可能造成事故），然后手持試管央夾將離心管放在水浴中，待乙醇沸騰后兩分鐘取出（注意；勿使乙醇在沸騰時沖出管外），離心2000轉分，10分鐘，棄上清（此上清中含有脂類）。（5）在離心管中加入 8mL5三氯醋酸，用玻璃棒攪起沉淀，在90水浴中加熱 15分鐘取出稍冷后離心 2000轉分，10分鐘，傾上清于10mL量杯中加水至 10mL（此液含有核酸，可用以定量）。將沉淀棄之。（6） RNA定量：取試管4支，按表加入試劑（加地衣酚試劑時可用滴管）試管H2O標準RNA液檢品（由操

23、作所得上清）地衣酚123（標準）4（空白）1.8mL1.8mL2.0mL - -2.0mL-0.2mL0.2mL - -4.0mL 4.0mL4.0mL4.0mL 將各管內容物混勻后在沸水浴中加熱25分鐘后，用水道水冷卻以后用665nm或紅色濾光板比色。（7）DNA定量取試管4支，按下表加入試劑（加二苯胺試劑可用滴管）試管H2O標準DNA液樣品（由操作5所得上清）二苯胺試劑123（標準管)4（空白管）-2.0mL-2.0mL-2.0mL2.0mL - -4.0mL4.0mL4.0mL4.0mL各管內容物混勻后在沸水浴中加熱15分鐘，冷卻后比色，用595nrn或紅色濾光板。（8）計算：RNA含量

24、： RNAg/100mg新鮮組織=Du/Ds80（g）10/0.2100/400=Du/Ds1000 DNA含量DNAg/100mg新鮮組織=Du/Ds200（g）10/2100/400=Du/Ds250 【注】（1）RNA及DNA定量比色時，注意勿使比色液外濺，以免損傷儀器及衣物。因地衣酚試劑及二苯胺試劑中含濃酸，比色完畢后廢液倒入水道時，必須用大量水沖洗水道，否則試劑中濃酸會腐蝕水道，比色杯及時洗凈空干。（2） 鼠肝的RNA含量約9001000g100mg組織；DNA含量約為220g100mg組織。實驗四 微量凱氏定氮法目的1. 掌握微量凱氏定氮法測定樣品總氮量和蛋白質的原理和方法2. 學

25、會使用凱氏定氮儀原理凱氏(Kjeldahl)定氮法常用于測定天然有機物(如蛋白質，核酸及氮基酸等)的含氮量。天然含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫被分別氧化成CO2和H2O，而氮則變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨，是為“消化”。該反應進行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀/硫酸鈉以提高反應的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑促進反應的進行。以甘氨酸為例，其消化過程可表示如下：NH2濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量及一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標準無機酸滴定，直至恢復溶液中原來氫離子濃度

26、為止，最后根據(jù)所用標準酸的當量數(shù)(相當于待測物中氨的當量數(shù))計算出待測物中的氮量。(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 NH4OHNH4OH H2O + NH3NH3 + H3BO3 NH4H2BO3NH4H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3滴定時用甲烯藍和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5.25.6，將NH4H2BO3的藍/綠色滴至原來H3BO3的藍紫色即為終點。本法適用范圍0.21.0mg氮，相對誤差應小于2%。材料、試劑與器具材料卵清蛋白、面粉等含蛋白質樣品試劑1. 濃硫酸(化學純)2. 30%氫氧化鈉(分析純)溶液3. 0.9%NaCl溶液4. 硫

27、酸鉀-硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅以3:1 (W/W)配比混合研磨成粉末5. 2%硼酸6. 混合指示劑(田氏)：0.1%甲烯藍乙醇溶液50ml與0.1%甲基紅乙醇溶液200ml混合配成(貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時為紫色，堿性時為綠色，變色范圍窄且靈敏)7. 0.0500M HCl8. 硼酸-指示劑混合液： 2%硼酸溶液100ml，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可(約加1ml左右混合指示劑)。9. 標準硫酸銨溶液(0.3mg N/ml)器具凱氏燒瓶 消化架 吸量管(1ml, 2ml) 量筒(10ml) 凱氏定氮蒸餾裝置微量滴定管(3ml, 5ml, 可讀至0.02ml) 錐形

28、瓶(50100ml) 容量瓶(50ml)操作步驟 樣品的處理血清樣品：取人血(或豬血)放于離心管中，于冰箱中放置過夜，次日離心除去凝血塊，上層黃色透明清液即為血清。準確吸取血清1.0ml加入0.9%NaCl 4.0ml，仔細混勻備用。固體樣品：在稱量瓶中稱入一定量的磨碎的樣品，置105 (非游離的水不能在100以下烘干)烘箱內干燥4小時至恒重。 消化在50ml凱氏燒瓶內加2ml稀釋血清溶液或0.10.5g干燥樣品(直接加至燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上)。 向該燒瓶加入硫酸鉀-硫酸銅混合物約0.2克，濃硫酸310ml，小瓷片兩粒，搖勻。將燒瓶約60度角固定在鐵架上，瓶口放一小漏斗，在通風廚內的

29、電爐上消化。在消化開始時，應控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明藍綠色為止。消化完畢，待燒瓶內容物冷卻后，加蒸餾水10ml (注意慢加，邊加邊搖)。冷卻后將瓶內容物轉入50ml容量瓶，并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號備用。 蒸餾 1、儀器的洗滌：儀器應先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。 蒸餾器有幾種，應用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：開放自來水龍頭，使水E進入G，從K管流出(水不宜開得過大以免水從G管溢出)。開放P3，使水進入A室，漏斗D中加蒸餾水約10ml入B室。用拇指將管

30、口按緊，同時開放P1，則B室中的水先從Y型管口沖出，隨后A室中水經(jīng)K管流出，一般情況下如此重復洗滌兩次即可。若蒸餾器內有氨存在，則應加入蒸餾水后，不加樣品蒸餾一次方可使用(可用pH試紙檢查)。A為蒸氣發(fā)生室，P3為其開關，P1為出水開關，B為蒸餾室，與出氣管M相接，M管插入盛有定量硼酸液的錐形瓶，B室內有Y型管，一端與A室相通，另一端經(jīng)P4與漏斗D相連，可經(jīng)此將樣品及試劑加入B室，F(xiàn)為冷凝管，E為進水管，水經(jīng)F、G、K而流出，蒸餾時依次在B室加入消化好的樣品及NaOH, 二者反應產(chǎn)生氨，經(jīng)M管進入錐形瓶由硼酸吸收。圖1-1 凱氏微量定氮蒸餾裝置2、蒸餾標準樣品先用標準硫酸銨溶液試驗23次。蒸餾器洗凈后，開放P3，使水進入A室，水放至A室球部1/3