通絡(luò)益智散對(duì)擬血管性癡呆大鼠腦組織中Glu和GABA影響的實(shí)驗(yàn)研究(一)

1、通絡(luò)益智散對(duì)擬血管性癡呆大鼠腦組織中Glu和GABA影響的實(shí)驗(yàn)研究(一)    摘 要：目的：探討通絡(luò)益智散對(duì)擬血管性癡呆大鼠海馬區(qū)興奮性和抑制性氨基酸的影響。方法：選用改良的腦缺血再灌注配合腹腔注射硝普鈉降壓法復(fù)制血管性癡呆模型。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、通絡(luò)益智散大劑量組、通絡(luò)益智散小劑量組。給藥3周后，取海馬勻漿檢測(cè)谷氨酸（Glu）含量，并觀察海馬區(qū)-氨基丁酸（GABA）的表達(dá)。結(jié)果：通絡(luò)益智散可以顯著降低擬血管性癡呆模型大鼠海馬區(qū)Glu的含量、增強(qiáng)GABA的表達(dá)（P0.01）。結(jié)論:通絡(luò)益智散能夠通過調(diào)節(jié)血管性癡呆大

2、鼠海馬區(qū)Glu和GABA的含量保護(hù)腦組織，這可能是其治療血管性癡呆的作用機(jī)制之一。關(guān)鍵詞：血管性癡呆;谷氨酸；-氨基丁酸血管性癡呆(Vascular Dementia,VD)是由各種腦血管病所導(dǎo)致的癡呆綜合征。屬于中醫(yī)“呆病”、“文癡”、“健忘”等范疇。在我國由于腦血管病的多發(fā),使得VD成為高發(fā)疾病之一。目前國內(nèi)外對(duì)控制本病病程進(jìn)展尚無有效方法和藥物，但根據(jù)現(xiàn)在的研究結(jié)論認(rèn)為VD具有潛在的可防治性，其部分是可逆的1。本研究通過觀察通絡(luò)益智散對(duì)擬血管性癡呆大鼠GABA表達(dá)及Glu含量的影響，進(jìn)一步闡明通絡(luò)益智散對(duì)血管性癡呆的作用機(jī)制，為缺血再灌流后所致血管性癡呆的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 實(shí)驗(yàn)材料1

3、.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康9月齡Wistar雄性大鼠60只，質(zhì)量250±20 g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)過程中自由喂養(yǎng)。1.2 藥品與試劑硝普鈉粉針劑（北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)041011，50 mg /支）用雙蒸水配成1 mg/L溶液，黑紙包裹備用；尼莫地平(山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)041003，20 mg/片，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水配成1 mg/mL的混懸液)；通絡(luò)益智散由紅芪、當(dāng)歸、地龍、紅花、桃仁、葛根、核桃仁、石菖蒲、遠(yuǎn)志組成，將其水煎3次，合并濃縮為含生藥3.14 g/mL的藥液，高壓滅菌，4 貯存?zhèn)溆?。Glu及總蛋白測(cè)

4、試盒購自南京建成生物工程研究所，批號(hào)為20041207；SABC試劑盒和兔抗大鼠GABA由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。1.3 儀器2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 模型制備采用王蕊等2的改進(jìn)方法，將大鼠用3 %戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈（common caroAid arAeris，CCA），在夾閉雙側(cè)CCA之前，腹腔注射硝普鈉（2.5 mg/kg），隨即用無創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA10 min，共夾閉2次，每次間隔10 min，即采用2次缺血10 min、再灌10 min的方式。再通后傷口滴青霉素適量，縫合傷口，放回籠中，(2

5、7±0.5)溫度下飼養(yǎng)。在全部造模過程中用肛表密切測(cè)量大鼠肛溫，保持肛溫在37 左右，以防止低溫對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用。2.2 動(dòng)物分組及處理從60只大鼠中隨機(jī)選出10只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組只進(jìn)行麻醉，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不阻斷CCA及腹腔注射硝普鈉。其余50只造模，手術(shù)過程由于損傷喉返神經(jīng)、出血過多、麻醉過量，死亡6只大鼠，術(shù)后兩天相繼死亡4只，余40只大鼠隨機(jī)分為模型組、通絡(luò)益智散大劑量組、通絡(luò)益智散小劑量組、尼莫地平對(duì)照組，每組10只。所有大鼠從造模后第7 d開始給藥，1日1次。假手術(shù)組與模型組予生理鹽水；通絡(luò)益智散大劑量相當(dāng)于正常成人用量的20倍（濃度為3.14

6、 g/mL）；通絡(luò)益智散小劑量相當(dāng)于正常成人用量的5倍（濃度為0.785 g/mL）；尼莫地平組給予尼莫地平懸濁液（相當(dāng)于正常成人用量的20倍），給藥劑量均為0.01 mL/g，連續(xù)給藥21 d。2.3 標(biāo)本采集和處理治療結(jié)束后第28 d，迅速開胸暴露心臟，從左心室插入導(dǎo)管至主動(dòng)脈，于右心耳部剪一小口，用生理鹽水快速?zèng)_洗，直到右心房流出液清亮為止。洗畢將大鼠快速斷頭取腦，在冰盤上去除腦膜和血管，分離海馬稱重，放入玻璃勻漿器加9倍生理鹽水，在冰浴中勻漿，3000 r/min離心機(jī)離心10 min，取上清液予20 冰箱內(nèi)凍存待測(cè)。右半腦置于4 %多聚甲醛及0.1 mol/L磷酸緩沖液中固定72 h

7、后，取海馬常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀連續(xù)切片（4 m），40 水溫展片，明膠處理的載玻片撈片后置于60 的烤箱內(nèi)烤23 h。2.4 Glu的檢測(cè)依據(jù)試劑盒說明書步驟，用7220分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。2.5 GABA的檢測(cè)（1）對(duì)石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。脫蠟。滴加0.03 %H2O2的甲醇溶液(室溫)30 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶，然后蒸餾水洗3次。熱源修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)中，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔510 min，反復(fù)12次，冷卻后用PBS(pH 7.27.6)洗滌12次。用抗原修復(fù)液進(jìn)一步暴露抗原：將抗原（稀釋1200）修復(fù)液滴加

8、在切片上,室溫10 min后，用PBS (pH 7.27.6)洗滌3次。在切片上滴加封閉液，室溫20 min，甩去多余的液體，不能沖洗。滴加稀釋的一抗兔IgG，放入冷藏室過夜。第二天取出切片，放置至室溫后，用PBS(pH 7.27.6)洗滌3次，各2 min。再滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 溫度下放置20 min，用PBS(pH 7.27.6)洗滌3次，各2 min。滴加試劑SABC，在2037 溫度下放置20 min，用PBS(pH 7.27.6)洗滌3次，各5 min。DBA顯色：使用DBA顯色試劑盒（AR1022），取1 mL蒸餾水加試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后切片。室溫顯

9、色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在530 min。蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。取假手術(shù)組切片6張，用PBS代替一抗。（2）定量觀察：采用BI-2000圖像分析系統(tǒng)，于400倍放大條件下，在每張切片上隨機(jī)攝取5個(gè)視野，測(cè)陽性細(xì)胞的光密度值及灰度值，并做統(tǒng)計(jì)分析。2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，各實(shí)驗(yàn)組均數(shù)間的兩兩比較若方差齊則采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhanes T2 檢驗(yàn)。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 各組大鼠海馬勻漿中Glu含量的比較結(jié)果見表1。模型組與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)

10、Glu含量明顯升高（P0.01），說明造模成功；通絡(luò)益智散大、小劑量組Glu顯著低于模型組（P0.01），但與尼莫地平組比較無顯著性差異（P0.05），結(jié)果提示通絡(luò)益智散大、小劑量組能降低VD大鼠Glu含量，治療效果與尼莫地平相當(dāng)。3.2 各組大鼠海馬齒狀回GABA表達(dá)的比較結(jié)果見表2。模型組與假手術(shù)組相比，GABA平均光密度在CA1區(qū)均明顯減少，平均灰度值升高（P0.01）；各治療組與假手術(shù)組比較，除小劑量組外，其他兩組GABA平均光密度在CA1區(qū)均顯著升高，平均灰度值顯著降低（P0.01）；各治療組GABA平均光密度較模型組均顯著增多（P0.01），升高幅度以尼莫地平、大劑量、小劑量的順序

11、依次降低。表1 通絡(luò)益智散對(duì)VD大鼠腦組織Glu含量的影響（略） 注：與假手術(shù)組比較P0.01；與模型組比較P0.01表2 大鼠海馬CA1區(qū)平均灰度值及平均光密度值（略） 注：與假手術(shù)組比較P0.01；與模型組比較P0.01；與尼莫地平組比較P0.054 討論谷氨酸（Glu）是人和哺乳動(dòng)物腦內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸(EAAs)，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞，在學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性、神經(jīng)元發(fā)育和退化等方面亦有重要的作用。但過量的Glu對(duì)神經(jīng)元有明顯的損傷作用，因此已被認(rèn)為是內(nèi)源性興奮性毒素3。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其興奮毒性作用在急性腦缺血細(xì)胞凋亡、再灌注損傷和遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中起重要作用。GABA被認(rèn)為是

12、重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降低興奮性與神經(jīng)保護(hù)作用。因此，缺血再灌注后，Glu升高的同時(shí)如能出現(xiàn)GABA的釋放增高，這一過程則意味著可能建立對(duì)抗EAAs過量的保護(hù)機(jī)制4。本研究結(jié)果顯示:采用缺血再灌注制造的VD模型組大鼠海馬區(qū)Glu含量明顯高于假手術(shù)組(P0.01)，而GABA的表達(dá)則明顯低于假手術(shù)組(P0.01)；用藥后各組Glu含量降低，GABA表達(dá)增強(qiáng)。提示通絡(luò)益智散治療血管性癡呆的作用機(jī)制是：一方面通過降低海馬區(qū)興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量以減輕其興奮性神經(jīng)毒性作用；另一方面則通過增加海馬區(qū)抑制性氨基酸（IAAs）含量，以對(duì)抗EAAs的神經(jīng)毒性作用。因此，調(diào)節(jié)興奮性及抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡可能是通絡(luò)益智散治療血管性癡呆的機(jī)制之一。參考文獻(xiàn)：1王永炎.現(xiàn)代中醫(yī)臨床與研究血管性癡呆M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：255-259. 2王蕊,楊秦飛,唐一鵬,等.大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進(jìn)J.中國病理生理雜志,20