茶多酚干預(yù)乳腺癌組織及重要器官血管生成相關(guān)因子表達(dá)研究

1、茶多酚干預(yù)乳腺癌組織及重要器官血管生成相關(guān)因子表達(dá)研究    摘要：目的 觀察茶多酚對(duì)移植性小鼠乳腺癌（EMT6）組織與重要臟器（心、腦、腎）組織血管生成相關(guān)因子表達(dá)影響。方法 應(yīng)用小鼠可移植性乳腺癌EMT6 細(xì)胞株，經(jīng)培養(yǎng)傳代后，以純系BALB/c 小鼠為荷瘤動(dòng)物進(jìn)行移植，并采用茶多酚灌胃及局部注射兩種干預(yù)措施，以免疫組化方法檢測(cè)小鼠乳腺癌組織VEGF、bFGF、TIMP-2 表達(dá)，并測(cè)定心、腦、腎組織中VEGF及TIMP-2 表達(dá)。結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，茶多酚兩種給藥途徑的腫瘤組織VEGF、bFGF 陽(yáng)性表達(dá)明顯降低（P<0.05）；TIMP

2、-2 陽(yáng)性表達(dá)明顯增高（P<0.05）；而心、腦、腎組織VEGF、TIMP-2 陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）。 結(jié)論 茶多酚可明顯抑制新生血管生成相關(guān)因子表達(dá)，并特異性的作用于腫瘤靶點(diǎn)部位，預(yù)示在腫瘤治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：茶多酚；小鼠乳腺癌；VEGF；bFGF；TIMP-2；重要臟器（心、腦、腎）既往實(shí)驗(yàn)研究表明，茶多酚灌胃、腹腔與局部注射三種給藥途徑均能顯著抑制S180 小鼠腫瘤生長(zhǎng)1，并認(rèn)為降低腫瘤組織微血管密度（MDV）2、下調(diào)腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）陽(yáng)性表達(dá)與上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-2）陽(yáng)性表達(dá)是其抗腫瘤機(jī)制之一3。我們?cè)谧C實(shí)茶

3、多酚能夠抑制小鼠乳腺癌（EMT6）生長(zhǎng)4，并結(jié)合茶多酚干預(yù)后對(duì)EMT6 小鼠重要臟器微血管密度（MVD)研究結(jié)果，進(jìn)一步檢測(cè)了茶多酚干預(yù)后的EMT6 小鼠腫瘤組織及其心、腦、腎組織血管生成相關(guān)因子表達(dá)，用以初步判定茶多酚抗新生血管形成的特異性與在腫瘤治療中的應(yīng)用前景。1 材 料1.1 動(dòng)物與細(xì)胞系：雌性BALB/c 小鼠60 只，體重(20±2)g，購(gòu)自上海斯克萊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003，并在南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)SPF 環(huán)境下飼養(yǎng)。EMT6 小鼠乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2 藥物：茶多酚購(gòu)自浙江東方茶業(yè)有限公

4、司，純度98（批號(hào)：20050334）；人參皂苷Rg3（參一膠囊）每粒含人參皂苷Rg3 10 mg，購(gòu)自吉林亞泰有限公司（批號(hào)：20040704）。1.3 儀器：超凈工作臺(tái)系蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)（型號(hào)sa-cj-zFD）；離心機(jī)由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)（型號(hào)KA-1000）；萊卡倒置顯微鏡為德國(guó)萊卡公司產(chǎn)品（型號(hào) DMIL）；Forma 恒溫培養(yǎng)箱為美國(guó)Forma 公司產(chǎn)品（型號(hào)3111）。1.4 試劑：美國(guó)GeneTech 公司生產(chǎn)的VEGF Ab（C-1)，批號(hào)：GT 300229；TIMP-2 Ab-2，（批號(hào)：IM56T）以及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）Ab-FGF2（批

5、號(hào)：BA0259）均購(gòu)自博士德生物工程有限公司；免疫組化超敏鼠組織試劑盒（UltraSensitiveTMS-P）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。2 方 法2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與接種：EMT6 細(xì)胞用含10 小牛血清的RMPI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后用0.25胰酶消化，培養(yǎng)液吹打離心，收集細(xì)胞用PBS 稀釋，濃度調(diào)至5×106，每只小鼠以0.2 ml 接種于小鼠右后背部。12 天后腫瘤長(zhǎng)至1g 時(shí)移植。2.2 腫瘤移植：斷頸處死荷瘤小鼠，75酒精浸泡35min 后放于超凈工作臺(tái)平皿中，用高壓滅菌的手術(shù)器械剪開(kāi)腫瘤皮膚，分離腫瘤包膜，取出腫瘤以消毒后的PBS 清洗，稱重，按每

6、克腫瘤4ml 溶液的比例用生理鹽水稀釋。剪碎瘤體，充分勻漿制成細(xì)胞懸液，濃度調(diào)至2×106，每只小鼠于右后背部皮下接種0.2ml。2.3 分組及用藥：接種第13 天腫瘤長(zhǎng)至1mm3 時(shí)（成瘤48 只），隨機(jī)分為4 組，即茶多酚灌胃組、茶多酚局部注射組、人參皂苷Rg3 灌胃組，模型對(duì)照組。每組12 只動(dòng)物。所有給藥劑量均采用人與動(dòng)物劑量換算法確定。即：茶多酚灌胃組：按人治療量900mg/d 計(jì)算，換算成實(shí)驗(yàn)用藥中劑量為11.25mg/kg，并按小鼠體重20g 計(jì)算，以2.25mg/d 配置濃度5.625mg/ml，每天灌胃0.4ml。茶多酚局部注射組：參考茶多酚腹腔注射LD50 160

7、mg/kg劑量，取其1/4 量為實(shí)驗(yàn)用小劑量組，換算成實(shí)驗(yàn)用藥中劑量為12mg/kg，以2.4mg/d 配制濃度24mg/ml，每天局部注射0.1ml。人參皂苷Rg3 組：按人治療腫瘤劑量40mg/d 計(jì)算，換算成20g 小鼠劑量為0.1mg/d，配制濃度為0.25mg/ml，每天灌胃0.4ml。模型對(duì)照組：生理鹽水灌胃，每天0.4ml。在接種第13 天開(kāi)始給藥、給水，每日1 次，連續(xù)給藥10 天。第11 天處死小鼠，取腫瘤及心、腦、腎組織制備切片待撿。2.4 血管因子檢測(cè)：將腫瘤組織及心、腦、腎組織取出后迅速放置于10%福爾馬林溶液中固定，第二天脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片為4um 厚，其中取一

8、張做HE 染色，其余每組選取3個(gè)組織切片，按相關(guān)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)VEGF、bEGF 與TIMP-2 表達(dá)。用PBS 作為一抗做陰性對(duì)照。染色陽(yáng)性者為棕黃色，部位在內(nèi)皮細(xì)胞胞漿。各組選取腫瘤組織及心、腦、腎組織各3個(gè)組織切片，每片選3 個(gè)視野，用美國(guó)TN-8502 圖像分析系統(tǒng)作圖像分析，測(cè)定光密度（IOD）值，取其平均值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示。2.5 統(tǒng)計(jì)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5 計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05 時(shí)表示差異有顯著性，當(dāng)P>0.05 時(shí)表示無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。3 結(jié) 果3.1 腫瘤組織血管相關(guān)因子測(cè)定：EMT6小鼠腫瘤組織VE

9、GF、bFGF、TIMP-2 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1；組化染色圖片見(jiàn)圖112。從表1 可以看出，與模型組比較，茶多酚灌胃、局部注射以及Rg3 干預(yù)后腫瘤組織的VEGF、bFGF 表達(dá)明顯減少，而TIMP-2 明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明抑制腫瘤組織VEGF、bFGF 表達(dá)，增加TIMP-2 表達(dá)是茶多酚抑制EMT6 生長(zhǎng)機(jī)制之一。3.2 重要臟器血管相關(guān)因子測(cè)定：EMT6 小鼠心、腦、腎組織VEGF、TIMP-2 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2；組化染色圖片見(jiàn)圖1324。4 討 論腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與瘤區(qū)血管豐富程度有密切的關(guān)系。腫瘤新生血管為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)輸送營(yíng)養(yǎng)并排泄代謝產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移灶形成也依賴于

10、新生血管生成?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)證明，腫瘤體積超過(guò)2mm3 時(shí)，都有新生血管生成。因而有效抑制血管新生，切斷腫瘤血供，有望達(dá)到抑制腫瘤生及轉(zhuǎn)移效果5-6。故抗腫瘤新生血管生成研究已成為腫瘤臨床治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前認(rèn)為，腫瘤血管生成過(guò)程可分血管內(nèi)皮細(xì)胞增值、血管基底膜破壞、血管內(nèi)皮細(xì)胞游走與構(gòu)成血管樣結(jié)構(gòu)四個(gè)主要步這驟，其中也包含腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相互作用的細(xì)胞外基質(zhì)、相關(guān)細(xì)胞參與以及大量細(xì)胞因子調(diào)節(jié)程度等生理、病理變化過(guò)程7。而抗腫瘤血管生成主要策略是針對(duì)腫瘤血管調(diào)控因子及其作用環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)?？鼓[瘤血管生成藥物也直接或間接在于血管相關(guān)因子。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲

11、分裂素，能選擇性增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成，并能提高血管尤其是微小血管的滲透性，使血漿大分子外滲沉積在血管外基質(zhì)中，從而為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和新生毛細(xì)胞血管網(wǎng)的建立提供了營(yíng)養(yǎng)條件。因此，VEGF是抗腫瘤血管生成藥物作用的重要靶點(diǎn)部位8。已研制的VEGF及VEGFR單克隆抗體主要用以封閉已分泌的VEGF及VEGFR，可以阻止VEGF誘發(fā)內(nèi)皮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。如針對(duì)VEGFR的酪氨酸激酶抑制劑鈥淪U5416鈥澮呀孝罅俅彩匝?；针对VEGF的單克隆抗體鈥淎dvastin鈥澮咽雜糜謚琢雋俅倉(cāng)瘟疲昧艘歡牧俅擦菩9。但因價(jià)格昂貴與有嚴(yán)重毒副反應(yīng)未能在我國(guó)廣泛推廣應(yīng)用。在血管生成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中

12、，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）起著關(guān)鍵作用。bFGF 能促進(jìn)表皮、內(nèi)皮細(xì)胞再生、血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，并從基膜中分離出來(lái)以刺激內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織趨化運(yùn)動(dòng)，并形成管狀結(jié)構(gòu)；同時(shí)，還能提高組織中血纖維蛋白溶解酶原激活因子以及能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生其他蛋白酶，從而促進(jìn)毛細(xì)血管形成10?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在降解血管基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞的胞外基質(zhì)，破壞血管結(jié)構(gòu)，使內(nèi)皮細(xì)胞從血管壁上脫落以形成新生血管這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用11。MMPs 抑制劑能夠通過(guò)抑制MMPs 的蛋白水解活性，能夠有效的抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤轉(zhuǎn)移。按照功效分類(lèi)，MMP 抑制劑有人工合成和天然存在的兩種形式。其中，組織金屬蛋白酶抑制

13、劑(TIMP)為天然存在的金屬蛋白酶抑制劑，所有的TIMP 家族成員不僅能抑制血管生成，還可以直接遏止腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)；人工合成的腫瘤血管活性藥物如batimastat(BB94)、marimastat(BB2516)等也已試用臨床試驗(yàn)12。但實(shí)際療效有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。茶多酚是從綠茶中提取的多酚類(lèi)活性物質(zhì)，其不僅具有預(yù)防心腦血管疾病、抗衰老等功能效應(yīng)，近些年的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚還具有防治腫瘤效應(yīng)。對(duì)其作用機(jī)制認(rèn)為與茶多酚直接殺傷腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抗突變、抗轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系13-14。我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚能夠抑制腫瘤新生血管生成2-3。但其是否在抑制腫瘤新生血管的同時(shí)，對(duì)正常組織器官微血管具有抑制效應(yīng)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道。為解決這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，在該課題研究中，除選擇了茶多酚干預(yù)治療后EMT6 腫瘤組織的VEG