長(zhǎng)鏈CpG寡脫氧核苷酸DNA重組質(zhì)粒對(duì)禽流感滅活疫苗免疫應(yīng)答的影響.docx

1、長(zhǎng)鏈CpG寡脫氧核昔酸DNA重組質(zhì)粒對(duì)禽流感滅活疫苗免疫應(yīng)答的影響*司興奎，陳建紅，張濟(jì)培（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東佛山528231）摘要：為明確導(dǎo)入長(zhǎng)鏈CpG寡脫帝核替酸3個(gè)DNA重組質(zhì)粒對(duì)禽流感H5亞型滅活疫苗的免疫應(yīng)答的影響，將21日齡試臉雛雞隨機(jī)分為6組，即健康對(duì)照組（A組）、疫苗對(duì)照組（B組）、空載體對(duì)照組（C組）、pUC26免疫促進(jìn)組（D組）、pUC3（）免疫促進(jìn)組（E組）及pUC44免疫促進(jìn)組（F組），對(duì)6組雛雞在首免后18周（WPI）檢測(cè)其HI抗體水平并在1、4及8WPI測(cè)定脾臟、法氏黃及胸腺免疫器官指教。研究結(jié)果表明：在2WPI,D（PvO.（）1）、F（PvO.（）

2、1）及E組（Pv（）.05）HI抗體水平極顯著或顯著高于C組；在3WPI.F組HI抗體水平分別顯著高于B（PVO.O5）、C（PVO.O5）及£組（PV0.05）；在5WPI,F（PvO.（）l）和】）（Pv（）.O5）組HI抗體水平極顯著或顯著高于C組；在6WP1.F組HI抗體水平顯著高于C組（PV0.05）；在8WPI,F組HI抗體水平極顯著高于B（P<0.01）或（2組（P<0.（）l）o在4WPI,A組胸腺指數(shù)極顯著或顯著高于C（P<0.05）及。組（Pv（）.（）l）,E組胸腺指數(shù)顯著高于。組（PV0.05）；在8WPI,E組脾臟指數(shù)顯著高于人組（PV0.

3、05）。關(guān)鍵詞：CpG寡脫敏核昔酸DNA重組質(zhì)粒;禽流感滅活疫苗；免疫應(yīng)答;免疫器官指數(shù)EffectsofRecombinantPlasmidsContainingLongStrandCpGOligodeoxynucleotidesDNAonImmuneResponsesofInactivatedAvianInfluenzaVaccine,SIXingkui,CHENJianhong,ZHANGJipei(DepartmentofAnimalMedicine,FoshanScienceandfechnologyUniversityJ'oshan,Guangdong528231)Abst

4、ract：ToclarifytheimmunologicalenhancementeffectsofthreerecombinantplasmidscontainlongstrandCpGoIigodeoxynucleotidesDNAtorecombinantavianinfluenzavaccine(H5N1,Re-1),21-day-agechickenwererandomlydividedinto6groupsi.eA(healthycontrol).B(vaccinecontrol)C(vacantvectoran<lvaccinecontrol),D(pUC26enhance

5、mentgroup),E(pU(30enhancementgroup)andF(pUC44enhancementgroup).TheserasamplesofeachgroupwerecollectedatIto8weekspostthefirstinjinunizatinn(WPI).andspleen,bueaandthymusindexeswereobtainedat1,4and8WPI.TheresultsshowedthatHIantibodytitersofgroupD(P<0.01),F(P<0.01)andE(P<0.05)weresignificantlyh

6、igherthanthoseofgroupCat2WPI；andHIantibodylitersofgroupFwerestatisticallyhigherthanthoseofgroupB(P<0.()5),C(P<0.05)andE(P<0.05)at3WPI.respectively;andHlantibodylitersofgroupF(P<0.01)收隔日K：2009-04-29修回日那：2009T）6-09基金項(xiàng)目：廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)H資助（2004A2090103）andD(P<0.05)weresignificantlyhigherthanthos

7、eofgroupCat5WPI；andHIantibodytitersofgroupFwerestatisticallyhigherthanthoseofgroupC(P<0.05)at6WPI；andHIantibodytitersofgroupFwerestatisticallyhigherthanthoseofgroupB(P<0.01)andgroupC(P<0.01)at8WPI.Forthymusindexes,groupAweresignificantlyhigherthanroupC(P<0.05)andgroupD(P<0.01)at4WPI,g

8、roupEwerestatisticallyhigherthangroupD(P<0.05)at4WPI,groupEwerestatisticallyhigherthangroupA(P<0.()5)at8WPI.Keywords：CpGODNDNArecombinantplasmids:inactivatedavianinfluenzavaccine；immuneresponse；immuneorganindex在70年前,Feund,J發(fā)現(xiàn)死亡的分枝桿菌對(duì)易感動(dòng)物具有不依賴(lài)抗原的免疫刺激活性，隨后的研究證實(shí)弗氏佐劑的這種免疫激活作用與特定的短鏈細(xì)曲DNA序列部分相關(guān)，該短鏈細(xì)

9、菌DNA序列可提高接受基因免疫的動(dòng)物的Thl型反應(yīng)。進(jìn)一步的研究結(jié)果證實(shí)，分枝桿菌DNA中的CpG基序?yàn)槠渚哂忻庖哓菁せ钚缘闹饕?。除?xì)菌中CpGDNA夕卜，人工合成的含有CpG基序的脫氧寡核甘酸（oligodeoxynucleotides,ODN）也可激活機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此，近年來(lái)CpGODN成為醫(yī)學(xué)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并顯示出較廣闊的應(yīng)用前景。本研究對(duì)已成功構(gòu)建的導(dǎo)入K鏈CpG寡脫氧核樣酸的3個(gè)DNA重組質(zhì)粒對(duì)禽流感H5亞型滅活疫苗的免疫應(yīng)答的影響進(jìn)行研究，以期篩選出具有免疫激活作用的含K鏈CpG寡脫軾核甘酸DNA重組質(zhì)粒。1材料與方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物144R21日齡

10、禽流感非免疫石岐雜雛雞購(gòu)自南海種雞場(chǎng)。1.1.2重組質(zhì)粒含11J3及10個(gè)ctagatcgtcgttttGTCGTTTTGTCGTTGAGGGGGGAT拷貝K鏈CpGODNDNA并克隆入pMD18-T載體的3個(gè)重組于pUC26、pUC3（）及pUC44由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院禽病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建國(guó)。1.1.3疫苗、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)抗原及陽(yáng)性血清重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型,ReT株）（2008014）為哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品。禽流感H5亞型HI抗原（20080212）、禽流感H5H1血清（040522）均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所產(chǎn)品。1.2方法1.2.1試驗(yàn)動(dòng)物分組方法將144H21日齡禽

11、流感非免疫惟雞分為6組,24只/組,即A、B、C、D、E及F組。各組情況見(jiàn)表1o表1試驗(yàn)雛雞的分組及免疫情況組別210齡免疫方法42日齡免疫方法A注射生理鹽水（）.5mL/只注射生理鹽水I.OniL/只.作為健景對(duì)照鈕B肌注禽流感技苗（L5mL/只肌注禽心疫苗C除向B外.機(jī)注溶于20%作陪溶液的pUCl««體（500jig/只）除同B外.肌注溶于20%赧稽溶液的pUC18fl體0.5mL/只(S00pig/只)0.5mL/只D除何B外,肌注溶F溶液的pUC26重31千（500乂"只）除呵B外.肌注溶于2<1%掠精溶液的pUC26索組子0.5n】L/只(50(

12、)pig/只)0.5mL/只E除同B外.凱注溶于211%城的溶液的pUC30重甄子（50OIHJ/FD除同B外，|11注涪于20%/糖溶液的pUC30子0.5mL/只(500)0.5ml./只F除同B外注溶f31%醞籍溶液的pUC44政蛆子（500a"只）除同B外，機(jī)注溶于20%蔗籍溶液的pUC440.5m【./只(500MR/只血5ml/只1.2.2血液樣品采集方法各組在免疫前（隨機(jī)采取13只）及免疫后1、2、3、4、5、6、7及8周（WPI）經(jīng)頸靜脈采集血液，分離血清.-20%：保存?zhèn)錂z。1.2.3HI抗體水平檢測(cè)方法采用微最血凝抑制試驗(yàn)（HI）方法進(jìn)行，具體按照高致病性禽流感疫

13、情處置技術(shù)規(guī)范（試行）（2004）進(jìn)行，相應(yīng)抗體水平以（X±SD）表示，采用t檢驗(yàn)對(duì)HI抗體水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.2.4免疫器官指數(shù)的測(cè)定方法在1、4及8WPI各組隨機(jī)稱(chēng)量5只錐雞的單重（g）,經(jīng)頸靜脈放血處殺后，采集對(duì)應(yīng)各組各只雛雞的胸腺、脾臟、法氏囊稱(chēng)重（mg）,以每只雛雞的各免疫器官重量（mg）與相應(yīng)單重（g）相除即得相應(yīng)免疫器官指數(shù)（以（又士SD）表示），采用t檢驗(yàn)對(duì)各組免疫器官指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2結(jié)果與分析2.1各組HI抗體水平檢測(cè)結(jié)果對(duì)各組免疫前及免疫后18WPI血清進(jìn)行HI抗體水平檢測(cè)，免疫前13只維雞H5抗體水平均低于21og2,免疫后的抗體檢測(cè)結(jié)果表明：A組在1

14、WPI為零，旦整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中雛雞健康抗體始終為零,B、C、D、E及F組的HI抗體水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2及圖1。如表2及圖1可見(jiàn)，在2WPI,D（Pv0.01）、F（Pv0.01）及E組（Pv（）.05）HI抗體水平極顯著或顯著高于C組;在3WPI,F組HI抗體水平分別顯著高于B（PvO.O5）、C（PvO.O5）及E組（PvO.05）；在5WPI,F（Pv0.01）和D（P<0.05）組HI抗體水平極顯著或顯著高于C組；在6WPI,F組HI抗體水平顯著高于C組（氏0.05）;在8WPI,F組HI抗體水平極顯著商于B（PV0.01）和C組（PV0.01）。綜上，在重組禽流感病毒滅活疫苗的5組中

15、,HI抗體水平最高的為F組（pUC44組）,D組次之（PUC26組），隨后為B組（疫苗對(duì)照組）、E組（pUC30組），相對(duì)最差的為C組（載體對(duì)照組）。表2免疫后不同時(shí)間HI抗體水平檢測(cè)結(jié)果1。宓江：差異星魯（氏0.05）;*星異級(jí)基著（氏0.01）,下固，組別1WPI2WP13WPI4WPI5WP16WPI7WPI8WPIA00000000B0.410.74.0±2.35.8+I.67.4±1.39.6±0.59.7±0.89.0±0.97.9±1.7C0.3±0.72.6±1.55.3±2.16.8&#

16、177;1.49.0±0.88.9±|.08.9+1.17.5±1.5D05.1±1.2-6.3+1.67.3±0.79.8±0.5*9.6+0.59.3±1.58.512.0E0.1+0.45.0+2.6,4.8±2.67.8±1.69.0*1.48.8M.38.8±1.87.812.1F0.41V.76.0±2.0"7.8±1.9,8.0±1.810.0±0"9.8±0.5*9.3+1.09.8±0.5-圖1免疫

17、后不同時(shí)間HI抗體的消長(zhǎng)曲線(xiàn)圖1免疫后不同時(shí)間HI抗體的消長(zhǎng)曲線(xiàn)(警一)*一h2.2各組免疫器官指數(shù)的測(cè)定結(jié)果在1、4及8WPI對(duì)各組隨機(jī)抽取的5只雛雞測(cè)定相應(yīng)的脾臟、法氏囊及胸腺的免疫器官指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3O由表3可見(jiàn)，在4WPI,A組胸腺指數(shù)極顯著或顯著高于C（P<0.05）及D組（PV0.01）,E組胸腺指數(shù)顯著高于D組（PV0.05）；在8WPI,E組脾臟指數(shù)顯著高于A組（PV0.05）。就脾臟、法氏囊及胸腺免疫器官指數(shù)總體來(lái)看（除4WPI時(shí),A組胸腺指數(shù)高于E組外），在4及8WPIE組較其他5組的免疫器官重量略高，提示其免疫系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育略好于其他各組，但其HI抗體水平卻低于F、D

18、及B組，結(jié)果不盡一致，造成這種情況的差異是由于不同CpGODNDNA誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)疫苗的選擇差異抑或是其他原因所造成，有待進(jìn)一步研究。表3免疫后不同時(shí)間脾臟、法氏囊及胸腺的免疫器官指數(shù)類(lèi)別免疫后周數(shù)ABCDEF脾臟指數(shù)11.85+0.742.0210.621.9310.631.6010311.64±0.492.07±0.6941.5310.301.79±0.292.17+0.651.64±0.561.6910.471.86±0.4()81.24+0.151.29±0.341.49±0.891.47±0.541.76

19、±0.46,1.64±0.56法氏囊指故14.27±1.994.37±0.553.77+0.793.87±1384.72U.793.0611.6843.45±1.502.88x1.043.37±0.363.63±0.983.58±1.242.66±0.7281.«6±0.762.09±1.251.94±0.781.95±1.012.19±0.781.55±0.66胸腺指數(shù)15.87±0.735.83+1.066.14

20、10.875.51±1.576.17±2.455.43+2.4247.4211.735.47+1.954.98±!.30,4.13±1.04-5.62±1.05,5.46±1.073討論修飾后才能抵抗體內(nèi)核酸酶的降解，從而延長(zhǎng)其人工合成的CpGODN必須進(jìn)行硫代磷酸化壽命和增強(qiáng)其免疫刺激作用。由此（下轉(zhuǎn)第35頁(yè)）等報(bào)道SOD活性在羅曼公雛感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后的盲腸組織中顯著降低，但在肝、脾、腎組織中顯著升高。金光明等報(bào)道SOD活性在羅曼公維感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后的心、肝、脾、肺組織中顯著升高,但在腎組織中無(wú)變化。分析其產(chǎn)生的原因，一是雞

21、的不同遺傳背景，二是組織器官在抗疾病中的生理功能的差異，三是能活力的測(cè)定方法或操作誤差,但筆者認(rèn)為前二者是主要的原因。在研究不同品種地方雞對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn),4個(gè)品種雞感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后，成活率、病變扣分、相對(duì)增敢率、卵囊值等方面存在著差異。其中固始雞對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感性最高，表現(xiàn)為感染后的死亡率最高、病變扣分最多，抗球蟲(chóng)指數(shù)也最低；汕雞對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的敏感性最低，表現(xiàn)為感染后的死亡率為零、病變扣分和血糞扣分最少，每雞平均排卵囊數(shù)最少，抗球蟲(chóng)指數(shù)最高；大骨雞和鹿苑雞對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的敏感性相近，位于固始雞與油雞之間。這種敏感性上的差異與其感染球蟲(chóng)后組織抗氧化功能活性的變化有何

22、關(guān)系，就本試驗(yàn)結(jié)果而言不十分明晰，但比較T-SOD活性在大骨雞、鹿苑雞、油雞和固始雞的肝臟、脾臟、腎臟、心臟和有腸組織中的變化，發(fā)現(xiàn)在油雞體內(nèi)有些特點(diǎn),T-SOD活性在肓腸組織內(nèi)持續(xù)下降。參考文獻(xiàn)：1索勛，李國(guó)清.雞球蟲(chóng)病學(xué)：M.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998.149-151.2竇新紅.不同品種雞對(duì)柔撤艾美耳球蟲(chóng)的敏感性和組織抗皈化功能活性的比較研究D.揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué),2006,22-26.3李佩國(guó)，李魚(yú)玉，張香齋.等.推雞感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后血消生化指標(biāo)的動(dòng)恣變化J).中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008,28(6):676-679.4聶奎，李竟，肖昌.等球蟲(chóng)病及藥物對(duì)錐雞LPO含址和SOD、GSH-

23、Px活性水平的影響.四川畜牧獸醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，20()1,15(2)：1-6.5楊保收，陳越，龔偉，等.釵自由基致?lián)p傷的分子生物學(xué)機(jī)制UL中國(guó)獸醫(yī)雜志，1999,25(1)：41-45.6HarmanD.Freeradicaltheoryofaging:Alzheimer'sdiseasepathogenesisJ.Age,1995,18(3)：97119.7金光明，張岱芋，顧有方，等.柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染后組織抗機(jī)化功能的動(dòng)態(tài)變化IJL中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,22(3):233-235.8鄭明學(xué).站克光，古少眄.等.惟雞感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后脂質(zhì)過(guò)敏化物的變化JJ.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào).2002,22(3):236-237.(上接第31頁(yè))就導(dǎo)致其成本很高，嚴(yán)重限制了在獸醫(yī)臨床生產(chǎn)中的應(yīng)用。如果通過(guò)合成雙鏈CpGDNA并克隆入載體構(gòu)建成重組質(zhì)粒后，即可獲得大量的CpGDNA,成本大大降低。許洪林等首先構(gòu)建分別導(dǎo)入9和16拷貝的CpGODN。體外試驗(yàn)表明，隨著插入CpGODN拷貝數(shù)的增加，活化小鼠B細(xì)胞誘生IgM能力逐漸增強(qiáng)，而活化NK細(xì)胞誘生IFN-7能力依次降低。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，16拷貝的CpGODN能明顯提高IgGl亞型抗體水平，但所有質(zhì)粒DNA均能顯著提高特異性IgG2a亞