血小板多態(tài)性和嬰兒頭內(nèi)出血的聯(lián)系

1、血小板多態(tài)性和嬰兒頭內(nèi)出血的聯(lián)系     本文作者：張茜 程欣茹 徐淑玲 時贊揚 盛光耀 單位：鄭州大學第一附屬醫(yī)院兒科 鄭州市婦幼保健院兒科早產(chǎn)兒顱內(nèi)出血(ICH)是由多種原因引起的以顱高壓、呼吸衰竭、抽搐及黃疸等為主要表現(xiàn)的危重疾病，胎齡越小，發(fā)病率越高，該病死亡率及致殘率極高，嚴重者可有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。近年來，隨著圍產(chǎn)醫(yī)學及新生兒重癥監(jiān)護技術(shù)水平不斷提高，早產(chǎn)兒存活率逐年增高，ICH發(fā)生率也有增無減。已經(jīng)證實血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activatingfactoracetylhydrolase，PAF-AH)基因第9外顯子Val

2、279Phe的單核苷酸多態(tài)性是成人急性腦出血的危險因素1-3。早產(chǎn)兒ICH除了與自身的解剖生理特點和多種圍產(chǎn)期高危因素，如腦室管膜下生發(fā)基質(zhì)不完善、凝血因子缺乏、缺氧酸中毒及腦血流動力學等有關(guān)外，是否也同PAF-AH第9外顯子Val279Phe單核苷酸基因突變有相關(guān)性，目前尚未見相關(guān)報道。本研究采用聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreac-tion，PCR)檢測PAF-AH基因型及等位基因的分布情況，分析其與早產(chǎn)兒ICH的相關(guān)性，尋找早產(chǎn)兒ICH易感基因，探討早產(chǎn)兒ICH的發(fā)生機制。1資料與方法11研究對象選取2011年7月至2012年2月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護室(

3、NICU)住院的早產(chǎn)兒(胎齡27+336+6周)作為研究對象。ICH的診斷標準依據(jù)實用新生兒學第4版4，頭顱B超對顱內(nèi)中心部位病變分辨率高，為ICH的特異性診斷手段，本研究所有早產(chǎn)兒生后3d內(nèi)均進行床旁頭顱B超檢測，根據(jù)有無ICH分為出血組及對照組。出血組共58例，其中男37例，女21例，胎齡27+336+6周，出生體重9002750g。根據(jù)出血程度分度:度22例(腦室管膜下出血);度18例(腦室出血不伴腦室擴張);度15例(腦室出血伴腦室擴張);度3例(腦室出血伴腦實質(zhì)出血)。對照組共65例，其中男40例，女25例，胎齡27+436+6周，出生體重10002870g。所有早產(chǎn)兒均排除了重度窒

4、息、先天畸形及遺傳代謝性疾病。兩組早產(chǎn)兒性別、胎齡及出生體重的差異無統(tǒng)計學意義。本研究征得患兒家屬同意并簽署知情同意書，研究方案經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。12研究方法121基因組DNA的提取外周股靜脈采血2mL，2%EDTA抗凝，置4冰箱保存，采用蛋白酶K-酚氯仿法提取DNA。122引物的合成與PCR的擴增針對PAF-AH基因第9外顯子Val279Phe正常等位基因及突變等位基因，參照文獻5設(shè)計4條引物:上游引物A:5'-CTACAAATTTATATCATGCTT-3'下游引物B:5'-TTTACTATTCTCTTGCTTTAC-3'下游引物C:

5、5'-TCACTAAGAGTCTGAATAAC-3'下游引物D:5'-TCACTAAGAGTCTGAATAAA-3'。引物由上海生物工程公司合成。其中引物A+B特異性擴增PAF乙酰水解酶的全部第9外顯子，引物A+C擴增正常等位基因，引物A+D擴增突變等位基因。PCR反應(yīng)體系共50L，其中2×TaqmasterMix(Fermentas)25L，10mol/L引物各2L，DNA模板06g，不足體積用滅菌雙蒸水補足至50L。PCR循環(huán)條件:94預(yù)變性5min;94變性、56退火、72延伸各1min，共5個循環(huán);94變性、56退火、72延伸各30s，共25個

6、循環(huán);最后72延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳液為05×TAE液，電壓100V，50min后置5g/LEB中染色15min，PCRMarker(Promega)作參照，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。13統(tǒng)計學分析分別計算各組基因型和等位基因的頻率。應(yīng)用SPSS170軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗;組間基因型及等位基因頻率比較采用2檢驗。P005為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果21電泳檢測基因多態(tài)性引物(A+B)PCR特異性擴增片段長160bp，為PAF-AH的第9外顯子片段;引物(A+C)、(A+D)分別擴

7、增正常等位基因(G)及突變等位基因(T)，片段長均為108bp。根據(jù)所加入的不同引物擴增結(jié)果，鑒定所有樣本基因型。均以第9外顯子擴增片段為陽性前提，樣本如僅能擴增出正常等位基因片段者，為正常基因型(GG);僅擴增出突變等位基因片段者，為突變純合子基因型(TT);若兼而有之則為突變雜合子基因型(GT)。見圖1。22兩組早產(chǎn)兒PAF-AH基因型及等位基因頻率的比較經(jīng)檢驗，兩組基因型分布均符合Hardy-Wein-berg遺傳平衡(P005)，說明資料具有群體代表性。出血組與對照組PAF-AH基因型和等位基因分布見表1。因TT型例數(shù)少，計算2值及P值時將TT型歸入GT型一起分析。出血組及對照組均存在

8、PAF-AH基因多態(tài)性，在對照組中，基因型頻率的分布以GG型最常見，GT型次之，等位基因的頻率以G最常見。與對照組比較，出血組GT型明顯增高，GG型明顯下降，等位基因T的基因頻率明顯增高，兩組PAF-AH基因型及等位基因分布頻率的差異有統(tǒng)計學意義(P005)。3討論早產(chǎn)兒ICH發(fā)生過程復(fù)雜。小于32周的早產(chǎn)兒腦室周圍室管膜下及小腦軟腦膜下存在胚胎生發(fā)層基質(zhì)，其血管壁缺乏膠原纖維及彈力纖維的支持，僅含單層內(nèi)皮細胞，對缺氧、酸中毒極敏感，易發(fā)生壞死、崩解而出血，同時產(chǎn)生大量血小板活化因子(PAF);ICH時中性粒細胞產(chǎn)生PAF，血管內(nèi)皮細胞在缺血應(yīng)激下也可產(chǎn)生PAF，進而對腦循環(huán)起重要作用。而其腦

9、組織中脂質(zhì)結(jié)構(gòu)也十分豐富，對PAF、氧自由基損傷非常敏感。另外，PAF通過內(nèi)皮細胞使血管通透性增加，導(dǎo)致血管源性腦水腫，PAF還可使腦血管自主調(diào)節(jié)功能紊亂，使腦血流隨著外周血壓的變化而產(chǎn)生波動，即壓力被動性腦血流，增加了ICH的風險。PAF-AH基因突變，使PAF-AH酶水平及活性降低，對PAF的降解功能不全，可使PAF水平升高。升高的PAF增加內(nèi)皮細胞鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并引起內(nèi)皮損傷5，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙、血管通透性增加、腦血管自動調(diào)節(jié)功能受損。同時，升高的PAF活化環(huán)加氧酶依賴途徑和電壓門控鉀離子通道途徑兩種獨立旁路，并使內(nèi)皮細胞膜表面的神經(jīng)磷脂酶依賴性的微囊蛋白富集，降低一氧化氮的含量，

10、與損傷的內(nèi)皮細胞一起引起腦損傷6。PAF-AH可以水解甘油骨架上含有短鏈殘基的氧化磷脂7，PAF-AH缺乏能夠引起氧化磷脂的積聚，加速血管的損傷。本課題組在前期的研究中已經(jīng)檢測了ICH早產(chǎn)兒活動期、穩(wěn)定期PAF及PAF-AH水平，并設(shè)正常早產(chǎn)兒進行對照，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒ICH活動期較出血穩(wěn)定期及無出血組早產(chǎn)兒PAF-AH活性明顯降低、PAF水平顯著增高，提示PAF及PAF-AH參與了早產(chǎn)兒ICH的發(fā)生8。PAF-AH屬于磷脂酶A2家族，廣泛分布于機體的各種組織，該酶能夠嚴格控制體內(nèi)PAF濃度9，對PAF起關(guān)鍵性的降解作用。PAF具有較強且多種生物活性，能夠活化血小板和其他炎癥細胞，在感染、變態(tài)反應(yīng)、

11、呼吸、消化、心血管及神經(jīng)等系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。因PAF-AH對PAF的降解作用，使其在體內(nèi)對多種疾病的防治都有重要作用。Stafforini等10發(fā)現(xiàn)PAF-AH基因第9外顯子存在Val279Phe單核苷酸多態(tài)性，該位點通過編碼基因GT變異，使遺傳密碼子由GUU轉(zhuǎn)變?yōu)閁UU，最終導(dǎo)致氨基酸纈氨酸(Val)苯丙氨酸(Phe)的轉(zhuǎn)變。由于突變位點位于酶活性的中心位置絲氨酸-273、天冬氨酸-296，該位點是蛋白質(zhì)適當折疊保持活性的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致其雜合子(Val/Phe)基因型酶活性是正常(Val/Val)基因型的一半，純合子的酶活性幾乎無法測出(Phe/Phe)11。目前

12、發(fā)現(xiàn)Val279Phe單核苷酸多態(tài)性與銀屑病、哮喘、心腦血管等疾病有關(guān)，并證實其為成人腦血管疾病的獨立危險因素10，12-13。本研究發(fā)現(xiàn)對照組PAF-AH基因第9外顯子T等位基因攜帶率為100%，明顯低于日本人群(215%)11，也低于國內(nèi)周春等14報道的1528%(中國廣西人群)。與對照組相比，發(fā)生ICH的早產(chǎn)兒PAF-AH基因第9外顯子突變基因型和T等位基因頻率均顯著升高，這表明PAF-AH基因第9外顯子Val279Phe單核苷酸多態(tài)性可能是早產(chǎn)兒ICH的遺傳易感因素。研究發(fā)現(xiàn)，PAF-AH對Wnt旁路起負性調(diào)節(jié)作用15，而動物實驗表明，Wnt旁路的抑制增加了血管出血的風險16-17。這可能也是PAF-AH基因Val279Phe單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致早產(chǎn)兒ICH的因素之一。