質(zhì)譜定量的原則系列講座

1、質(zhì)譜定量的原則系列講座（轉(zhuǎn)自分析測(cè)試百科叮當(dāng)空間）質(zhì)譜定量的原則01-目錄：1質(zhì)譜定量的簡(jiǎn)介a) 總離子流b) 選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）c) 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM/MRM）2開發(fā)一個(gè)SRM方法3內(nèi)標(biāo)4PK/LC/MS/MS 藥物代謝動(dòng)力學(xué)的LC/MS/MS的反相液相色譜的方法開發(fā)5樣品制備6標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備a) 做標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟b) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋方案Scheme的舉例c) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的運(yùn)行d) 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的隨機(jī)化e) 系統(tǒng)運(yùn)行的實(shí)用性f) “QCs”質(zhì)量控制7相關(guān)的PK資源8定量的技巧Tips質(zhì)譜定量的原則02質(zhì)譜定量的簡(jiǎn)介和LC/MS監(jiān)測(cè)的模式簡(jiǎn)介本教程主要用于：使用質(zhì)譜作小分子藥代

2、動(dòng)力學(xué)分析，即PK/MS。除此之外，這些同樣的原則也可用于生物基質(zhì)中肽和蛋白的定量。傳統(tǒng)上，在使用現(xiàn)代質(zhì)譜定量之前，定量是用HPLC高效液相色譜和UV紫外檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)的。HPLC 藥代動(dòng)力學(xué)分析建立在保留時(shí)間、峰面積和紫外光譜性質(zhì)的基礎(chǔ)上的。HPLC方法的缺點(diǎn)是靈敏度不夠、缺乏特異性。我們已經(jīng)看到一些實(shí)例，一個(gè)化合物的確已經(jīng)代謝了，然而保留時(shí)間和紫外光譜上，母離子和代謝物無法區(qū)分。這種缺少特異性的分析時(shí)不時(shí)會(huì)誤導(dǎo)研究者。所以在藥代動(dòng)力學(xué)分析中，基于質(zhì)譜的表征現(xiàn)在是一種新型的重要的工具。質(zhì)譜定量中已經(jīng)被廣泛接受的方式是MS/MS定量。這種定量常通過三級(jí)四極桿或離子阱質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)。要求使用MS/MS的原

3、因是：許多化合物有同樣的質(zhì)量。當(dāng)使用第一個(gè)維度即單級(jí)質(zhì)譜MS去定量時(shí)，也會(huì)缺乏特異性，尤其是對(duì)于像血液那樣的復(fù)雜的基質(zhì)。第二個(gè)維度的MS（即MS/MS）在大多數(shù)情況下，能夠提供唯一的斷裂。合并特異的母離子質(zhì)量和唯一的碎片離子信息，可以選擇性地監(jiān)測(cè)被定量的化合物。下面我們將討論獲得和可視化LC/MS數(shù)據(jù)的方法。獲得和可視化LC/MS的數(shù)據(jù)，或稱為：質(zhì)譜數(shù)據(jù)如何在一個(gè)LC/MS實(shí)驗(yàn)中表達(dá)？典型的方法，質(zhì)譜被設(shè)置為掃描特定的質(zhì)量范圍。在全掃描分析中，質(zhì)量掃描范圍較寬；在選擇離子監(jiān)測(cè)SIM時(shí)，質(zhì)量掃描范圍較窄。依賴于掃描的類型，一個(gè)獨(dú)立的質(zhì)量掃描時(shí)間可以從10 ms到5秒。在一次LC/MS分析中可獲得

4、許多個(gè)掃描。LC/MS數(shù)據(jù)的表示方法為：把每個(gè)質(zhì)量掃描的離子流信息疊加，畫出隨時(shí)間變化的總離子流，橫軸是時(shí)間，縱軸是強(qiáng)度?？傠x子流圖非常像HPLC的紫外圖，見圖1。下面我們將討論各種掃描的模式，和這些模式同質(zhì)譜定量的關(guān)系。最常見的LC/MS數(shù)據(jù)模式為：（1）   總離子流圖（2）   選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）（3）   選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）：MRM和SRM本質(zhì)上是同樣的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ健?全掃描分析圖1 圖1.gif (2.85 KB)2007-7-17 17:00從藥代分析中得到的全質(zhì)量范圍的總離子流圖（TIC）非常像

5、HPLC UV圖，除了：質(zhì)譜能檢測(cè)到更多的化合物，尤其是沒有紫外吸收的化合物?？傠x子流是一個(gè)疊加圖，疊加了每個(gè)質(zhì)量掃描的離子流。當(dāng)一個(gè)小分子或小肽流出HPLC色譜柱時(shí)，相對(duì)強(qiáng)度上升，在TIC圖上出現(xiàn)了一個(gè)峰，橫軸是時(shí)間。每個(gè)質(zhì)量的化合物都被記錄在TIC圖上。找出感興趣的化合物可能是困難的，因?yàn)樵S多化合物有相同的質(zhì)量?；衔锏奶烊毁|(zhì)量不是鑒定的唯一性數(shù)據(jù)。設(shè)置一個(gè)確定的質(zhì)量，可以畫出一個(gè)提取離子流圖，但這個(gè)圖的強(qiáng)度會(huì)比下面介紹的SIM實(shí)驗(yàn)中的強(qiáng)度低。（注意：TIC指的是在一段時(shí)間內(nèi)采集的質(zhì)量掃描數(shù)據(jù)，不特指掃描范圍或質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的類型。例如，我們可以在SIM或SRM實(shí)驗(yàn)中獲得TIC圖。然而，為簡(jiǎn)單起

6、見，我們將把這些圖稱為SIM和SRM圖，而不是SIM TIC圖。）Selected Ion Monitoring選擇離子監(jiān)測(cè) 在選擇離子監(jiān)測(cè)中，質(zhì)譜被設(shè)置為掃描一個(gè)非常小的質(zhì)量范圍，典型的是一個(gè)質(zhì)量數(shù)的寬度。選擇的質(zhì)量寬度越窄，SIM的確定度越高。SIM圖就是從非常窄的質(zhì)量范圍中得到的離子流圖。只有被該質(zhì)量范圍選擇的化合物才會(huì)被畫在SIM圖中。圖1和圖2是同一個(gè)樣品的譜圖，然而它們看起來很不相同。原因是在SIM圖中，畫的是TIC圖中較少的組分。SIM圖是比TIC圖更確定的圖。圖2圖1.gif (2.85 KB)2007-7-17 17:00然而，SIM圖仍顯示了許多峰，不能唯一地確認(rèn)我們感興趣

7、的化合物。一個(gè)復(fù)雜的樣品（比如血清或血漿）中，這樣的圖是一個(gè)典型的SIM圖。許多化合物有同樣的質(zhì)量，在ESI中還有多電荷峰也和我們感興趣的化合物有同樣的m/z值。SIM實(shí)驗(yàn)比全掃描實(shí)驗(yàn)更靈敏，因?yàn)橘|(zhì)譜在一個(gè)更小的質(zhì)量范圍上駐留（dwell）更長(zhǎng)的時(shí)間。Selected Reaction Monitoring選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè) （SRM）SRM被大多數(shù)科學(xué)家在質(zhì)譜定量中使用，見圖3。SRM中，可以監(jiān)測(cè)一個(gè)特征的唯一的碎片離子，在很多非常復(fù)雜的基質(zhì)中進(jìn)行定量。SRM圖非常簡(jiǎn)單，通常只包含一個(gè)峰。這種特征性使SRM圖成為靈敏度高且特異性強(qiáng)的理想的定量工具。圖3圖3.gif (2.36 KB)2007-7-

8、17 17:00SRM的過程：選擇一個(gè)特征的母離子做MS/MS，在其碎片中選擇一個(gè)特征的子離子作為監(jiān)測(cè)離子?？梢园裇RM理解為碎片離子的SIM。這種特征性的實(shí)驗(yàn)被成為“transition”（躍遷），可以表示為：母離子 子離子，舉例：534 375質(zhì)譜定量的原則03建立一個(gè)SRM Transition 534 375一個(gè)定量分析方法應(yīng)該是特征性的、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的。在不犧牲上述特性的前提下，建立方法應(yīng)該盡可能地快速，質(zhì)譜定量可以很好地滿足這些規(guī)則。在建立一個(gè)感興趣的化合物的MS/MS碎片transition的時(shí)候，一種優(yōu)化transition的方法是用注射泵進(jìn)樣（syringe pump）

9、該化合物來優(yōu)化。先在全掃描方式中優(yōu)化母離子信號(hào)。因?yàn)镸S/MS的靈敏度將依賴于化合物在全掃描模式中是否響應(yīng)得好，要盡可能地優(yōu)化全掃描的、非CID響應(yīng)的MS信號(hào)。然后優(yōu)化碰撞能CE和碰撞氣體，給出豐度最高的碎片離子。不能使用太大的碰撞能CE，因?yàn)樘蟮腃E會(huì)丟失穩(wěn)定的、有價(jià)值的碎片峰。“我應(yīng)如何優(yōu)化碎片峰？”可以用注射泵進(jìn)樣化合物，進(jìn)行MS/MS，挑出一個(gè)穩(wěn)定的碎片峰，當(dāng)改變碰撞能和碰撞氣體參數(shù)時(shí)監(jiān)測(cè)它的離子流。最后當(dāng)獲得最大的碎片離子峰響應(yīng)時(shí)確定碰撞能和碰撞氣體參數(shù)?，F(xiàn)代的三重四極桿質(zhì)譜都可以自動(dòng)優(yōu)化。圖4.gif (3.32 KB)2007-7-17 17:09從優(yōu)化好的MS/MS譜中，選擇

10、一個(gè)合適的碎片峰用于定量監(jiān)測(cè)。如圖A所示，母離子質(zhì)量為534，似乎從圖B中可以很容易選擇一個(gè)碎片峰做Transition。一個(gè)基本考慮是盡可能不要選擇離母離子太近的質(zhì)量。非常常見的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：53451717。我們應(yīng)盡可能不要選擇失水峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致一個(gè)不是很特異的transition。這里，Transition 534 375是一個(gè)好的選擇。另外要注意的是：要選擇一個(gè)穩(wěn)定的峰。當(dāng)直接進(jìn)樣化合物時(shí)，被選擇做Transition的峰必須每次掃描響應(yīng)都一致。提示：當(dāng)優(yōu)化MS條件時(shí)，最好能模擬實(shí)際做樣的條件。例如：實(shí)際做樣時(shí)色

11、譜流速是400 ul/min，化合物在30%有機(jī)相時(shí)流出，用注射泵進(jìn)樣優(yōu)化MS條件時(shí)最好模擬這個(gè)條件，即設(shè)置HPLC流速為400 ul/min，30%有機(jī)相；然后用三通注入化合物。同時(shí)，第一次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們可以選擇60/60的梯度，去表征化合物的疏水性，從而得知它在C18反相柱上的色譜行為。如果你對(duì)所有的化合物都按這樣的方法實(shí)驗(yàn)，你就可以建立一個(gè)洗脫數(shù)據(jù)庫(kù)，可以作為將來實(shí)驗(yàn)的參考。注： 60/60梯度的意思是：梯度從近100% 水相開始，在60分鐘內(nèi)到達(dá)60%有機(jī)相。質(zhì)譜定量的原則04內(nèi)標(biāo) 在做MS定量時(shí)應(yīng)該使用內(nèi)標(biāo)。選擇一個(gè)合適的內(nèi)標(biāo)，將能減少因?yàn)闃悠诽崛?、HPLC進(jìn)樣和離子化的多樣性造成

12、的差異。在復(fù)雜基質(zhì)的分析中，在SRM積分圖上，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的低端，常會(huì)見到：兩個(gè)不同的濃度水平，會(huì)給出近乎一致的響應(yīng)。只有當(dāng)使用一種內(nèi)標(biāo)時(shí)，這兩個(gè)點(diǎn)才能被區(qū)分。一些研究者試圖在實(shí)驗(yàn)中不用內(nèi)標(biāo)去做標(biāo)準(zhǔn)曲線，但成功率不高。我們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)曲線上每個(gè)濃度水平都重復(fù)進(jìn)樣3次。沒有內(nèi)標(biāo)的情況下，重現(xiàn)性RSD常常會(huì)高于20%；而當(dāng)使用內(nèi)標(biāo)時(shí)，%RSD能降低到近2%。我要如何選擇一個(gè)內(nèi)標(biāo)?最好的內(nèi)標(biāo)是待定量的化合物的同位素內(nèi)標(biāo)。同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)將和待測(cè)物有相似的回收率、ESI離子化響應(yīng)，和相似的色譜保留時(shí)間。如果你運(yùn)行的不是臨床藥代動(dòng)力學(xué)定量，可能很難判斷上述說法，因?yàn)樘厥獾暮铣梢粋€(gè)同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)，是非常昂貴和耗

13、時(shí)的。通常，如果你和一個(gè)醫(yī)學(xué)的化學(xué)家工作，他們會(huì)有一個(gè)化合物相似物庫(kù)，可以被用作內(nèi)標(biāo)。這些類似物，在化合物合成中被測(cè)試，和該化合物性質(zhì)相似可以被用戶定量?jī)?nèi)標(biāo)，而且更重要的是，這些類似物和該化合物的母離子質(zhì)量有微小的差異。盡量不要使用去甲基化（14）或者是氧化的（16）的類似物作內(nèi)標(biāo)，因?yàn)榇郎y(cè)化合物的母離子常會(huì)發(fā)生同樣的代謝。常見的做內(nèi)標(biāo)的類似物是氯代的化合物。氯代的化合物類似物會(huì)和待測(cè)化合物有相似的色譜保留時(shí)間，這是內(nèi)標(biāo)的一個(gè)重要特性。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)物的一個(gè)最重要的特性是它和待測(cè)化合物共流出。我該如何使用內(nèi)標(biāo)？首先，內(nèi)標(biāo)添加需在樣品測(cè)試方法的開始階段，典型的，應(yīng)在血漿crash或固相萃取之前

14、。內(nèi)標(biāo)應(yīng)用同一濃度水平添加（包括標(biāo)樣）。內(nèi)標(biāo)應(yīng)給出可靠的質(zhì)譜響應(yīng)。應(yīng)該注意的是：內(nèi)標(biāo)的量應(yīng)添加得合適，應(yīng)高于定量限，但不能過高，因?yàn)檫^高的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)會(huì)抑制被分析物的離子化?！拔覒?yīng)該添加多少量的內(nèi)標(biāo)？”這是一個(gè)重要的問題。通過做一些試分析：早、中、晚的時(shí)間點(diǎn)，也許一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，你應(yīng)該知道你的樣品中化合物的大概量。這些信息非常有價(jià)值，可以幫助建立一個(gè)合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并知道應(yīng)添加多少量的內(nèi)標(biāo)。舉例來說：如果待定量的樣品濃度范圍是100 fg 25 pg，檢測(cè)限是100 fg，你應(yīng)該添加510 pg的內(nèi)標(biāo)。一個(gè)好的經(jīng)驗(yàn)法則是：內(nèi)標(biāo)物的量大概是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度最高點(diǎn)的1/3。這將給出一個(gè)比較不錯(cuò)的響應(yīng)

15、，并且不會(huì)抑制和干擾待測(cè)樣品的離子化。見圖1圖1 內(nèi)標(biāo)的量（內(nèi)標(biāo).gif）質(zhì)譜定量的原則05液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用藥代動(dòng)力學(xué)方法開發(fā)更快就是更好！在每一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)分析中更快就是更好！樣品組/系列包括：重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)品，QC質(zhì)控樣品，和樣品，加起來大概要進(jìn)行300次分析。如果每個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)耗時(shí)15分鐘，整套分析要75個(gè)小時(shí)。高要求的實(shí)驗(yàn)（加上質(zhì)譜）總計(jì)要超過3天時(shí)間。一些該領(lǐng)域的研究者可以只花12分鐘分析一個(gè)樣品；而大多數(shù)的PK/MS的實(shí)驗(yàn)室一般很容易做到花34分鐘分析一個(gè)樣品。如果對(duì)上面同樣的300個(gè)樣，4分鐘一個(gè)實(shí)驗(yàn)的話，總分析時(shí)間可減少到20個(gè)小時(shí)。所以，每分鐘都是很重要的！在2mm×

16、 3050mm反相短柱上可以獲得快速的梯度和快速的平衡時(shí)間。LC/MS的非藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，流速一般為200 µl/min.，而在LC/MS的藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，流速一般設(shè)為400 1000 µl/min。更快的流速有助于加速洗脫和平衡。下面是典型的LC/MS藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)條件：LC/MS藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)方法：色譜柱：2.1 X 50 mm, 5 µm , 100 Å , C18柱溫： 40流動(dòng)相：A 為水相（0.1% 甲酸），B為乙睛（0.1%甲酸）流速： 400µl/min梯度： Time(min.)%B0252802.125425Notes：a ) 調(diào)節(jié)初始的B使其

17、適應(yīng)該化合物 b ) 試著減少梯度時(shí)間到1分鐘以縮短方法時(shí)間 優(yōu)化梯度：當(dāng)然你要對(duì)每個(gè)化合物特別的進(jìn)行方法優(yōu)化。我們推薦創(chuàng)建一個(gè)色譜數(shù)據(jù)庫(kù)，詳細(xì)地記錄實(shí)驗(yàn)室接手的各個(gè)化合物的疏水性（可以運(yùn)行60/60方法完成）。當(dāng)你需要挑選一個(gè)相似疏水性的內(nèi)標(biāo)時(shí)，這樣的色譜數(shù)據(jù)庫(kù)將非常有用。在長(zhǎng)時(shí)間的梯度中，B的起始值一旦明確，那么在縮短時(shí)間時(shí)，就把B的值降10%。舉例來說，如果B初始值是40%，那么在運(yùn)行液質(zhì)藥動(dòng)方法時(shí)，起始值%B就是30%。這種方法將確保你的化合物可以留在你的柱子上。優(yōu)化柱子和流動(dòng)相：在上面舉例的液相條件中，一些化合物有可能響應(yīng)得不好。一些化合物可能要求不同的有機(jī)改性試劑或有機(jī)相。一般，磷

18、酸鹽不適用于質(zhì)譜。有些人用1020mM低濃度的醋酸銨作A相緩沖鹽。另一些人合并甲醇和乙睛在B相中。如果你的化合物峰形不好，需要改變幾個(gè)或者所有的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。必須選用合適的柱子去獲得好的回收和好的峰形。幫助提示：1）一個(gè)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室可能要整日忙著做色譜方法開發(fā)，尤其是如果這個(gè)實(shí)驗(yàn)室每周要接510個(gè)新化合物樣品。在組合化合物和它們的內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行組合的色譜方法開發(fā)方面我們頗有心得。并不是所有的化合物適用于這種方式，但是這個(gè)方法為我們節(jié)省了大量的方法開發(fā)的時(shí)間。當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)做6個(gè)化合物混合樣的方法開發(fā)時(shí)間，和一個(gè)化合物的幾乎一樣時(shí)，這個(gè)在新的組合給藥（cassette dosing）方法開發(fā)中，該方法就變得非

19、常有用。注：cassette dosing 是一種新的給藥方法，稱為盒式給藥法，又稱為組合給藥技術(shù)，由Ber- man等提出，即給動(dòng)物同時(shí)服用幾種藥物，按常規(guī)取樣時(shí)間取血，運(yùn)用 HPLC聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行樣品處理分析。2）加速方法開發(fā)。許多常見化合物如布洛芬已經(jīng)有人建立了方法，檢索一下文獻(xiàn)、互聯(lián)網(wǎng)和USP的出版物，查到這些方法。不要浪費(fèi)時(shí)間從頭開始! 3）組合給藥技術(shù)常常加速化合物篩選過程。許多研究者不愿做組合實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是因?yàn)楹ε滤幬?藥物相互作用。一種可取的方式是給藥后合并化合物。合并上述的方法開發(fā)方法，可以為任務(wù)重的實(shí)驗(yàn)室節(jié)省大量的時(shí)間。4) HPLC自動(dòng)進(jìn)樣器往往是出奇的慢，記得在平衡時(shí)間里考

20、慮自動(dòng)進(jìn)樣器，因?yàn)楫?dāng)自動(dòng)進(jìn)樣器工作時(shí)，柱子是在初始化（initial）條件下被清洗的，必須在平衡時(shí)間里考慮這個(gè)時(shí)間。你可以從方法里砍掉3060秒的平衡時(shí)間。要分秒必爭(zhēng)嘛！從300個(gè)樣品分析中，每個(gè)砍掉3060秒，就是5個(gè)小時(shí)?。≠|(zhì)譜定量的原則06樣品的制備（適用于液質(zhì)藥動(dòng)分析的樣品制備）樣品一般在血漿或血清中。離心去除血液里的血細(xì)胞獲得血漿。血液凝固后去除固體得到血清樣品。凝固血液清除血液細(xì)胞和凝血因子。血清比血漿易于處理，因?yàn)槟蜃右呀?jīng)被去除。當(dāng)使用儲(chǔ)存的血漿時(shí)，常會(huì)發(fā)現(xiàn)蓬蓬的凝塊物，使樣品很難進(jìn)入吸液管pipette。不管是血清還是血漿，在進(jìn)入反相柱分析前都要作進(jìn)一步的處理。下面會(huì)討論幾

21、種的方法用以制備可以用作液質(zhì)藥動(dòng)分析的血漿和血清樣品。血漿破碎（crash）（有時(shí)稱蛋白沉降）血漿破碎/蛋白沉降是最常用的方法，因?yàn)樗话悴灰筇厥獾膬x器。用乙睛或甲醇沉淀去除豐度的白蛋白。一個(gè)典型的方法描述如下：前處理血漿蛋白沉淀.jpg (26.75 KB)血漿破碎（crash）/蛋白沉降方法：1）放50?l血漿或血清在0.5毫升管中2）加10?l內(nèi)標(biāo)3）添加140?l冷(凍)的有機(jī)溶劑（乙睛或甲醇）然后渦旋4）冷凍樣品2小時(shí)5）稍稍離心樣品，分離出沉淀的蛋白6）取150?l上清液至一干凈管，加150?l液相的A相(水相).在這時(shí)，樣品里含的有機(jī)相大概為38。如果你的化合物要求更低的有機(jī)相

22、，來保留在色譜柱上，應(yīng)增加第6）步添加的水相的量。7）把6）項(xiàng)的樣品，進(jìn)行HPLC進(jìn)樣做液質(zhì)聯(lián)用的藥動(dòng)分析。固相萃?。涸S多人首選固相萃取法SPE。在SPE中，血漿或血清被直接加入一個(gè)疏水的固相中，一般是C18小柱。加入后，用有機(jī)相淋洗小柱，則感興趣的小分子會(huì)被洗脫下來。SPE可以是手動(dòng)的，也可以是小批量的。手動(dòng)的SPE制備方法限制了樣品的通量。可以用96孔板做自動(dòng)化。一些人認(rèn)為96孔板非常貴，一個(gè)96孔板大約為100美元，但是痕量成本時(shí)應(yīng)該考慮易用性和最終產(chǎn)品的貢獻(xiàn)。一些人發(fā)現(xiàn)：用于液質(zhì)聯(lián)用藥動(dòng)分析的最終洗提液（eluant）質(zhì)量更好，反相柱的附著物和質(zhì)譜信號(hào)的滾動(dòng)（roll-off）發(fā)生在較

23、低的速率。液液萃取：必須承認(rèn)我們?cè)谶@方面沒有很多經(jīng)驗(yàn)。這里是我所知道的。液液萃取只工作在那些可以分隔進(jìn)入有機(jī)相的化合物。它可能是一種樣品凈化的有效方法。然后，這種技術(shù)很難自動(dòng)化。藥代的各種樣品處理藥代的各種樣品處理.jpg (97.48 KB)2007-7-17 23:29這是一個(gè)補(bǔ)充的圖，一種列表的方式，介紹各種前處理。 各課題組，都根據(jù)自己的需要選擇方式。 夢(mèng)想的方法是：簡(jiǎn)單的沉淀、離心蛋白法。這時(shí)候可能有堵的問題，因?yàn)樘幚矸浅：?jiǎn)單，也許會(huì)堵。所以各個(gè)用戶買液質(zhì)的時(shí)候會(huì)問賣液質(zhì)的銷售一個(gè)silly question：你們的儀器是不是可以直接做沉淀蛋白的，而不堵?。?#160;問的可愛，答的

24、“精彩”！質(zhì)譜定量的原則07質(zhì)譜藥動(dòng)定量分析的標(biāo)準(zhǔn)物和創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線簡(jiǎn)介 完整的定量分析依賴于參考標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量。一種合格的參考標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)能通過（pass）一系列定性參考標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試。參考標(biāo)準(zhǔn)的定性測(cè)試要設(shè)計(jì)為：充分地表征參考標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量和含量。如果參考標(biāo)準(zhǔn)的含量不對(duì)，那么建立在其上的定量分析一定是錯(cuò)的。然而，當(dāng)進(jìn)行“研究性藥動(dòng)”時(shí)，可能沒有足夠的時(shí)間去充分地表征化合物，因?yàn)楹芎?jiǎn)單，在一周內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室要做三種新化合物。所以，當(dāng)面臨開發(fā)一種“研究型藥動(dòng)”方法時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)努力建立一個(gè)假定的參考標(biāo)準(zhǔn)，在做整套化合物實(shí)驗(yàn)室保持不變，而且實(shí)驗(yàn)室能夠永久地獲得該假定參考標(biāo)準(zhǔn)，用于日后的參考。這個(gè)步驟能確保：每個(gè)相對(duì)于這

25、個(gè)假定的參考標(biāo)準(zhǔn)的藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虮粶y(cè)量。創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟在定量分析中也至關(guān)重要。為了使分析可靠，這個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)必須可靠，在創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線上的每一點(diǎn)時(shí)，每一次稱重和取液都必須準(zhǔn)確無誤。下面我們介紹，在液質(zhì)藥動(dòng)定量分析中典型的創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法。 創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線 匯集所有可能知道的關(guān)于未知樣品濃度范圍的信息，可以有計(jì)劃地繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以前曾介紹過一個(gè)快速的估算方法，早、中、晚的時(shí)間點(diǎn)伴隨著低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)。鬼峰將允許創(chuàng)建一個(gè)更適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)曲線范圍，并會(huì)告訴你應(yīng)注入多少量的樣品。這些步驟可以使你免于重復(fù)長(zhǎng)時(shí)間的開發(fā)。有些時(shí)間點(diǎn)可能包含高濃度的目標(biāo)化合物。這個(gè)初步的分析可以告訴你是否稀釋，例如，最早的時(shí)間

26、點(diǎn)乘以10倍，讓你建立一個(gè)更合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋方法舉例（你用的實(shí)際步驟可能與此區(qū)別很大，只把這個(gè)例子作為參考）在下表中的稀釋步驟描述了一個(gè)3X, (3X50 µl)制備過程，以表達(dá)最能模擬未知樣品制備的實(shí)際情況。這個(gè)表包括了：加入有機(jī)溶劑做蛋白沉降。標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備和用于分析的注入的體積，應(yīng)該反映未知樣品的分析工作。稱出大約1毫克的參考標(biāo)準(zhǔn),并重組為一個(gè)10 ug/毫升，稱量不到1毫克可能增大稱重誤差的可能性并傳遞誤差。一些疏水化合物可能要求兩步的重組。例如，一種疏水化合物可能不能溶于含水量高的溶液。試著在少量的DMSO中溶解這種化合物，然后在含最低量有機(jī)溶劑的溶液（這時(shí)化合

27、物是穩(wěn)定和可溶的）中重組。供應(yīng)這些化合物用以評(píng)估的藥用化學(xué)家，常常給出你關(guān)于溶解度和穩(wěn)定性的建議。（警告：這種稀釋方法可能會(huì)出錯(cuò)，你必須驗(yàn)證它。）參考標(biāo)準(zhǔn)濃度=10 µg/毫升（在不含血清的溶液中制備）溶液 A = 1 µg/ml     (100 µl 參考標(biāo)準(zhǔn) + 900 µl血清) 溶液B = 100 pg/ml (10 µl參考標(biāo)準(zhǔn) + 990 µl 血清) 溶液 C = 10 pg/ml   (10 µl參考標(biāo)準(zhǔn) + 9990 µl 血清) 溶液

28、D = 1 pg/ml     (10 µl 溶液 B + 990 µl 血清) 圖.jpg (36.36 KB)2007-7-18 14:13下載標(biāo)準(zhǔn)曲線法 standardcurve.rar (4.23 KB) standardcurve.rar (4.23 KB)下載次數(shù): 492007-7-18 14:11（注意這個(gè)稀釋程序可能有錯(cuò)，你必須驗(yàn)證它）方法注意：1   在加入有機(jī)物沉淀蛋白前，內(nèi)標(biāo)應(yīng)與樣品充分混合。盡可能地加入低濃度有機(jī)相的內(nèi)標(biāo)，這樣不會(huì)引起永久的沉淀。如果可能的話，用在血清中制備的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)液最好

29、。2   溶液A，B，C和D應(yīng)該在血清中制備，這樣標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品更接近未知的、在基質(zhì)中的實(shí)際樣品。3   當(dāng)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)避免系列的稀釋。因?yàn)槿绻诘谝淮蜗♂寱r(shí)，如果犯了一個(gè)錯(cuò)誤，那么系列的稀釋將造成錯(cuò)誤漫步在整個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線上。4   在配置溶液時(shí)，不要吸取< L的液體，更小的體積將導(dǎo)致更大的誤差。并且，確保你的移液管是校正過的。m10 5   用于這個(gè)步驟的血清總量是12.7 mL。運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線：由于標(biāo)準(zhǔn)曲線常?？缭饺齻€(gè)（濃度）數(shù)量級(jí)，通常，標(biāo)準(zhǔn)樣品從低濃度高濃度依次做樣。這個(gè)步驟保證不受高濃度標(biāo)樣的色譜交叉污染。在標(biāo)準(zhǔn)曲線運(yùn)行完后，要進(jìn)幾針空白，直到看不到