敗醬復(fù)方對混合菌液所致大鼠慢性盆腔炎的治療作用

1、敗醬復(fù)方對混合菌液所致大鼠慢性盆腔炎的治療作用         【關(guān)鍵詞】  敗醬摘要：目的：研究敗醬復(fù)方對混合菌液所致大鼠慢性盆腔炎的治療作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法：采用混合菌液注入劃傷的子宮內(nèi)造成大鼠慢性盆腔炎，將60只雌性 Wistar大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、陽性藥組和敗醬復(fù)方高、中、低劑量組，每組10只，造模后2d開始ig給藥，連續(xù)21 d。檢測血液流變學(xué)、免疫學(xué)指標(biāo)及病理學(xué)形態(tài)。結(jié)果：模型組大鼠全血粘度、血漿粘度和紅細(xì)胞壓積顯著升高，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)、血清IL2降低，IL6升

2、高；敗醬復(fù)方(ig,1.5、30、60gkg-1d-1)可不同程度改善上述指標(biāo)；組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)敗醬復(fù)方給藥組大鼠慢性盆腔炎病理改變明顯減輕。結(jié)論：敗醬復(fù)方對混合菌液所致大鼠慢性盆腔炎有顯著的治療作用，其作用機(jī)制可能與改善血液循環(huán)和調(diào)節(jié)免疫功能有關(guān)。關(guān)鍵詞：敗醬復(fù)方；慢性盆腔炎；血液流變學(xué)；免疫學(xué)；病理形態(tài)學(xué)             慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease, CPID)是婦科常見多發(fā)病，目前西醫(yī)療法以抗生素和皮質(zhì)激

3、素為主，對于改善癥狀有一定的療效，但有許多不良反應(yīng)，且很難消除病因1。中醫(yī)常采用活血化瘀、清熱利濕、溫經(jīng)散寒和理氣止痛等方法，往往有較好的療效。敗醬復(fù)方是結(jié)合中醫(yī)理論研制的復(fù)方中藥制劑，多年臨床實踐表明，該藥對診斷明確的慢性盆腔炎患者有較好的療效，但作用機(jī)制尚不明確。本實驗采用混合菌液致大鼠慢性盆腔炎模型，觀察該復(fù)方對慢性盆腔炎的治療作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。1 實驗材料11 動物和儀器雌性Wistar大鼠60只，8周齡，體重200±20g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，動物許可證號SYXK(鄂)2004004。Stat Fax2100酶聯(lián)免疫檢測儀為美國Awareness

4、公司產(chǎn)品，YDAIV(A)型全自動血液粘度儀為北京宏潤達(dá)公司產(chǎn)品，超凈工作臺為蘇州凈化公司產(chǎn)品。12 藥品、試劑及菌種敗醬復(fù)方由敗醬草、連翹、苦參、赤芍、黃柏、丹參、蒲公英和甘草等組成，上述藥物由中國科學(xué)院武漢植物研究所江明喜研究員鑒定。用適量冷水浸泡30分鐘，武火急煎10分鐘，再用文火慢煎20分鐘即可，由武漢大學(xué)藥物非臨床研究中心制備。婦科千金片，規(guī)格為032g/片，含生藥34g/片，湖南株洲制藥廠生產(chǎn)，批號200407077。高效植物凝集素(PHA)為暨南大學(xué)暨東生物工程研究所產(chǎn)品；IL2、IL6試劑盒由深圳晶美生物試劑有限公司提供；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司；RPMI16

5、40培養(yǎng)液和小牛血清購自GIBCO公司。菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌由武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗科臨床分離并保種，以211的比例溶于無菌生理鹽水配成濃度為3×109 ml-1的混合細(xì)菌懸液。2 結(jié)果21  模型的建立2用03%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠(50mgkg-1)，無菌條件下于大鼠下腹部正中切口0.81cm，暴露并固定子宮，用注射器機(jī)械損傷子宮內(nèi)膜組織，注入0.2ml混合細(xì)菌懸液至子宮雙側(cè)內(nèi)，縫合切口，恢復(fù)飲水，正常清潔飼養(yǎng)。假手術(shù)組操作基本同模型組，但子宮內(nèi)未注射混合菌液。22 分組及給藥將60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，于造模后2d開始ig給藥

6、，連續(xù)21天。敗醬復(fù)方低、中、高劑量組分別ig敗醬復(fù)方15、30、60gkg-1d-1；陽性藥組ig婦科千金片2.8gkg-1d-1；假手術(shù)組及模型組ig等體積生理鹽水，各組給藥容積均為15mlkg-1。23  觀察指標(biāo)及測定方法231 血液流變學(xué)指標(biāo)       末次給藥12小時后，各組大鼠麻醉后頸總動脈抽血測定全血粘度、血漿粘度和紅細(xì)胞壓積。232  免疫學(xué)指標(biāo)       IL2和IL6測定取大鼠肝素抗凝血，離心分離血漿，按試劑盒說明書采用雙抗體夾心

7、法測定IL2和IL6濃度。脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)測定       于給藥30 d后，無菌條件下取脾，按文獻(xiàn)3方法，用RPMI1640培養(yǎng)液制作單細(xì)胞懸液，并用TrisNH4Cl破壞紅細(xì)胞，鏡檢活細(xì)胞數(shù)90%后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×106L-1，將細(xì)胞加入16孔培養(yǎng)板中，每樣品2孔，每孔1ml，其中一孔加入細(xì)胞周期分裂素(PHA，5mgL-1)，另一孔作對照。置37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h后，將細(xì)胞移入40孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液100l，并加入5%MTT溶液10l，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加100l酸性異丙醇充分混勻，終止

8、反應(yīng)，用酶聯(lián)免疫檢測儀作比色測定，計算脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)(脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)=加PHA淋巴細(xì)胞OD值未加PHA淋巴細(xì)胞OD值)。         233  子宮病理形態(tài)學(xué)觀察       取大鼠雙側(cè)子宮稱重后，先肉眼觀察其炎癥反應(yīng)及周圍粘連情況，然后將子宮置10%福爾馬林溶液中固定，切片，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下鏡檢，攝片。病理觀察指標(biāo)及積分標(biāo)準(zhǔn)為：宮腔粘連閉塞或擴(kuò)張：“-”無病變；“+”1/3病變；“+”1/32/3病變；“+”2/3以上病變。

9、腔壁結(jié)構(gòu)病變：“-”各層結(jié)構(gòu)正常；“+”粘膜固有層腺體結(jié)構(gòu)消失；“+”肌層與粘膜層分界不清；“+”分層結(jié)構(gòu)不清。上皮細(xì)胞變性壞死：“-”單柱狀上皮；“+”上皮細(xì)胞扁平或脫落1/3；“+”上皮細(xì)胞扁平或脫落1/32/3病變；“+”全層上皮細(xì)胞變性壞死。慢性炎細(xì)胞浸潤：“-”無慢性炎細(xì)胞浸潤；“+”小數(shù)散在或灶性且僅在粘膜固有層內(nèi)；“+”散在或灶性但深入肌層；“+”多數(shù)散在或?qū)訝罱櫜⒗奂叭珜?。?nèi)膜充血水腫：“-”無內(nèi)膜充血水腫；“+”固有膜輕微充血水腫；“+”明顯充血水腫；“+”全層充血水腫。24  數(shù)據(jù)處理資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(3實驗結(jié)果31對血液流變學(xué)指標(biāo)的影響由表1可見，

10、模型組與假手術(shù)組比較全血粘度、血漿粘度和紅細(xì)胞壓積均顯著升高；敗醬復(fù)方給藥組全血粘度、血漿粘度和紅細(xì)胞壓積有顯著改善。表1 敗醬復(fù)方對血液流變學(xué)各指標(biāo)的影響(略）注：與假手術(shù)組相比，* P0.01；與模型組比較，# P0.05, P0.01。32 對免疫學(xué)指標(biāo)的影響由表2可見，敗醬復(fù)方高、中、低劑量組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)和血清IL2明顯升高，IL6顯著降低。表2 敗醬復(fù)方對免疫學(xué)指標(biāo)的影響(略）注：與假手術(shù)組相比，* P0.01；與模型組比較# P0.05, P0.01。33 對大鼠慢性盆腔炎組織形態(tài)學(xué)的影響假手術(shù)組：肉眼觀察子宮顏色、硬度正常，漿膜面未見腫脹、充血。鏡下宮壁各層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜表

11、面上皮偶見輕度增生，腺體未見明顯病變，間質(zhì)無炎癥反應(yīng)。模型組：肉眼觀察大部分子宮顏色暗紅，漿膜面明顯腫脹、充血，子宮重量增加，部分動物盆腔粘連。鏡下大鼠子宮粘連閉塞或擴(kuò)張，子宮壁完全被破壞、壞死，已失去原有正常形態(tài)，結(jié)構(gòu)紊亂，模糊不清，代之以多量成纖維細(xì)胞增生，以及炎性細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤為主；粘膜上皮細(xì)胞部分變性壞死脫落，各層組織壞死，形成無結(jié)構(gòu)形態(tài)；子宮腺體上皮壞死。敗醬復(fù)方組：子宮腫脹、充血等有不同程度減輕，少數(shù)子宮腺體腔閉塞，固有膜、肌層有輕度的炎性細(xì)胞浸潤，中、高劑量組成纖維細(xì)胞增生不明顯，其形態(tài)結(jié)構(gòu)較接近正常。陽性藥組：子宮腫脹、充血也有減輕，宮壁各層結(jié)構(gòu)尚

12、清晰。鏡下可見炎癥細(xì)胞浸潤及子宮內(nèi)膜腺上皮一定程度增生，成纖維細(xì)胞增生不明顯，個別動物子宮內(nèi)膜炎癥明顯。表3 敗醬復(fù)方對混合菌液引起的慢性盆腔炎大鼠子宮病理變化的影響(略)注：與假手術(shù)組相比，* P0.01；與模型組比較# P0.05, P0.01。4 討論對于慢性盆腔炎動物模型的建立，國內(nèi)學(xué)者4較早采用化學(xué)性燒傷致炎的方法造成大鼠子宮內(nèi)膜粘連模型，但它在感染方式、傳播途徑和病變特點(diǎn)上與人盆腔炎有較大的差別。所以，我們根據(jù)文獻(xiàn)2采用混合菌液加機(jī)械損傷的方法造成更貼近于人類盆腔炎的病理模型，觀察了敗醬復(fù)方的治療作用。結(jié)果顯示，敗醬復(fù)方給藥組子宮病變較模型組明顯減輕，表明敗醬復(fù)方對混合菌液所致慢性

13、盆腔炎有明顯的治療作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性盆腔炎病機(jī)主要為瘀、熱、濕三者蓄積胞宮，導(dǎo)致沖任氣血運(yùn)行不暢，為此我們選擇了血液流變學(xué)指標(biāo)進(jìn)行藥物療效的觀察。結(jié)果顯示，模型組大鼠全血粘度、血漿粘度和紅細(xì)胞壓積顯著升高，敗醬復(fù)方可不同程度改善上述指標(biāo)。這可能是由于本方中含有丹參、赤芍、蒲公英、連翹等活血化瘀成份，可改善慢性盆腔炎大鼠的血液循環(huán)，有利于炎癥細(xì)胞的吸收及子宮內(nèi)膜的修復(fù)。文獻(xiàn)還報道，敗醬草能增強(qiáng)網(wǎng)狀細(xì)胞和白細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)抗體形成及提高血清溶菌酶的水平，從而達(dá)到抗菌消炎的目的5。IL2是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中最重要的細(xì)胞因子之一，可通過促進(jìn)B細(xì)胞分裂、增殖以及NK細(xì)胞的活性作用，提高機(jī)體的免疫功

14、能6。IL6與其受體系統(tǒng)結(jié)合可促使分化成熟的B細(xì)胞分泌抗體，促進(jìn)TC、TD細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)效應(yīng)，過量IL6的產(chǎn)生，會導(dǎo)致過于劇烈的免疫反應(yīng)，對機(jī)體造成損害7。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)、血清IL2降低，IL6升高，敗醬復(fù)方各劑量組均可明顯提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)、升高IL2，降低IL6，表明慢性盆腔炎的發(fā)病與機(jī)體免疫功能低下或紊亂有關(guān)。增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫功能，使紊亂的免疫功能恢復(fù)正常可能是敗醬復(fù)方的作用機(jī)制之一。參考文獻(xiàn)1 Grado S. Inflammation of the pelvis minor. Orv Hetil, 1998,139:21152120.2 張小麗，張靜云，陳瑞明，等盆炎寧到混合菌液致大鼠慢性盆腔炎的治療作用的實驗研究中藥藥理與臨床，2005，21：3740.3 周道洪，洪元珊，趙曼瑞測定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和鼠白介素活性新方法MTT比色法中國免疫學(xué)雜志，1986，2：3941.4 陳靖宇，陳建民敗醬屬植物研究概況中草藥，1994，25：1011055 時燕平，傅友豐中藥三聯(lián)法治療慢性盆腔炎34例觀察中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，17：99100.6 Smith KA. Interleu