腎活檢組織標本的制作

1、第三章第10節(jié)腎活檢組織標本的制作前 言 腎活檢病理是診斷腎臟疾病的重要手段，許多疾病的命名主要源于腎活檢組織學改變，如局灶節(jié)段性腎小球硬化和膜性腎病。腎活檢病理診斷的正確性與腎組織標本制作質(zhì)量關(guān)系密切，質(zhì)量不過關(guān)（如切片不夠薄，染色不清晰）將直接造成診斷錯誤，因此，應(yīng)重視腎活檢標本處理（取材、固定、包埋、切片到染色）的各個環(huán)節(jié)，以保證病理診斷的正確性。腎臟病理包括尸檢和活檢標本，對于腎臟疾病而言，主要是活檢標本，本章主要介紹腎活檢標本的處理。目前常規(guī)腎活檢標本來源有兩類：一類為切割式活檢，一類為穿刺抽吸式活檢，前者所取組織較多，但對腎臟損傷較大，不便在臨床推廣，臨床常采用穿刺抽吸式活檢。一、

2、腎組織取材 腎活檢穿刺時病理技術(shù)員必須到場，以便對腎組織標本進行正確的處理，在技術(shù)員不能到場的情況下，必須按以下要求對標本處理者進行培訓：處理穿刺所獲組織應(yīng)輕柔，避免牽拉或用力鉗夾組織；分取組織時應(yīng)在蠟板上進行，用鋒利的刀片快速切割，避免用力擠壓組織；盡量用含固定液（光鏡或電鏡）和生理鹽水的專用鑷子把分割好的組織塊移入固定瓶內(nèi)；用鑷子時避免鉗夾組織過度而造成組織受擠壓；要求穿刺者盡量取兩條組織。穿刺所獲第一條含皮質(zhì)組織送光鏡檢查，第二條組織在肉眼觀察下進行分割，盡量切取皮質(zhì)區(qū)1mm組織送電鏡檢查，余下組織送免疫熒光檢查。如果穿刺僅獲一條組織，所取組織有三種情況（圖3-10-1）：整條均為皮質(zhì)，

3、皮髓組織和皮-髓-皮質(zhì)組織，髓質(zhì)區(qū)血供豐富，顏色略紅，皮質(zhì)區(qū)組織略白，分布的紅色小點是腎小球，根據(jù)穿刺獲取不同組織的情況，如圖3-10-1所示進行分取。也有人建議縱切后，一半送光鏡檢查，一半分割后分送免疫熒光和電鏡檢查，但存在組織太細，不易觀察的缺點，臨床較少使用。分送免疫熒光檢查的組織用無菌的TRIS或PBS溶液浸濕的沙布輕輕包裹，置于培養(yǎng)皿中，避免直接置于冰塊上，以免局部組織因冷凍收縮，造成結(jié)構(gòu)破壞1,2。腎活檢穿刺組織的分取圖3-10-1 腎活檢穿刺組織的分取LM：光鏡；IF：免疫熒光；EM：電鏡二、光鏡標本的處理 （一）固定光鏡標本的固定液有多種。目前最常用的固定液為10%的中性福爾馬

4、林。中性福爾馬林固定液的配方：甲醛（40%） 100 ml、蒸餾水 900 ml、磷酸二氫鈉4 g、磷酸氫二鈉 6.5 g，固定時間至少612 h。（二）前期處理1. 脫水 脫水的目的是去除固定和水洗后組織中的水分，便于后續(xù)的透明和浸蠟，常用的脫水劑是乙醇或丙酮，后者脫水能力比乙醇強，但對組織收縮較大，致使組織變脆，多用于快速脫水。為了徹底脫水，一般常規(guī)采用不同濃度梯度的乙醇進行脫水：70%乙醇 1020 min，2次；80%乙醇 1020 min，2次；90%乙醇 1020 min，2次；95%乙醇 1020 min，2次；無水乙醇 1020 min，2次。2. 透明 透明的目的是便于石蠟包

5、埋，因為組織脫水后，所用的脫水劑大多數(shù)不能和石蠟相混合，必須通過透明劑的作用才能浸蠟，所用的透明劑必須既能和脫水劑相混合，又能和石蠟相混合，起到橋梁作用，不但能提出脫水劑，又能代替脫水劑利于石蠟的浸入。當組織全部為透明劑占有時，光線可以透過，組織可呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，故稱為透明。透明劑都是石蠟溶劑，絕大多數(shù)都不能與水混合，最常用的透明劑包括二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油等。（1）二甲苯：是應(yīng)用最廣的一種透明劑，價格便宜，沸點為144C，折光率為1.497，易揮發(fā)，無色透明液體，易溶于乙醇又能溶解于石蠟，不能和水混合，透明力強，作用較快。最大的缺點是容易使組織收縮變硬變脆，所以組織不

6、能停留過久。通常在組織進入二甲苯以前先經(jīng)過1/2純乙醇和1/2的二甲苯的混合液。（2）甲苯：性質(zhì)同二甲苯，沸點110.8C，價格亦較便宜，透明較慢，但優(yōu)點是組織在其內(nèi)停留1224 h也不變脆，故優(yōu)于二甲苯。（3）氯仿：組織在其中浸存較久時收縮不明顯，也不變脆。因為它的易揮發(fā)性，滲入組織的氯仿，高溫時比二甲苯易揮發(fā)，是其優(yōu)點。缺點是滲透力稍弱，比二甲苯和甲苯慢，故透明時間較二甲苯時間延長2-3倍。3. 浸透和包埋 組織經(jīng)過脫水和透明后，要讓石蠟等支持劑透入內(nèi)部使組織變硬，并將組織包埋以利于切片，這個過程稱為“浸透”和“包埋”。浸透的目的在于去除組織中的透明劑而代之以石蠟，使石蠟滲入組織內(nèi)部后把軟

7、組織變?yōu)橛杏捕鹊南瀴K，便于切片。石蠟是最常用的包埋劑。使用優(yōu)質(zhì)石蠟?zāi)鼙ＷC切片厚度，無刀痕。根據(jù)石蠟熔點不同，石蠟分為軟蠟和硬蠟，軟蠟熔點低，硬蠟熔點高。一般在室溫高時用熔點高的蠟，室溫較低時用熔點低的蠟。4. 切片 將蠟塊修理成小梯形狀，進行連續(xù)切片，常規(guī)切片厚度為2 mm，有條件可進行1.5 mm的連續(xù)切片。對于特殊染色，如剛果紅則需厚度為5 mm的切片35。（三）染色腎組織標本既要觀察細胞結(jié)構(gòu)，又要觀察基底膜病變，許多腎臟疾病與免疫復(fù)合物相關(guān)，因此腎活檢標本除常規(guī)蘇木素-伊紅（Hematoxyln-Eosin，HE）染色，需要多種特殊染色如PAS（periodic-acid schiff，

8、PAS）、PASM（periodic acid-silver methenamine，PASM）和Masson三色染色等68。1. 蘇木素-伊紅染色法 HE染色法即常規(guī)染色法，主要顯示各種組織正常成分和病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)，進行全面觀察。目前關(guān)于病理組織學的基本知識，絕大部分都是基于對HE染色切片的觀察。在HE染色上基本可以觀察到各種組織或細胞的一般形態(tài)、結(jié)構(gòu)特點和病變的發(fā)生、發(fā)展及修復(fù)。（1）蘇木素染液配制方法：將蘇木素溶于乙醇，傾入明礬液中，混合后煮沸，加入氧化汞1 g，以玻棒攪勻，溶液呈深紫色，立即移入冷水中，使之冷卻。靜置過夜，過濾封閉保存，用前若加5醋酸則染色較佳。配方為：蘇木素 0.

9、9g、醋酸 12 ml、氧化汞 0.51.0 g、蒸餾水 200 ml、純乙醇 10 ml、甘油 20 ml、鉀明礬 20 g。（2）伊紅乙醇配制方法：將伊紅乙醇溶解后，用滴管滴加醋酸使其呈糊狀，加數(shù)毫升蒸餾水即可，過濾，將濾出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95乙醇200ml中即可。配方為：伊紅 1 g、蒸餾水10 ml、醋酸數(shù)滴。（3）染色過程：切片常規(guī)脫蠟入水；蘇木素染色310 min；自來水充分沖洗35 min；0.5%1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘；自來水沖洗15 min；弱堿性水溶液返藍；自來水至蒸餾水沖洗510 min或更長；0.5%1%的伊紅3 min；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。（

10、4）染色結(jié)果：細胞核被蘇木素染成鮮明的藍色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍色，黏液呈灰藍色。細胞質(zhì)被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞質(zhì)內(nèi)嗜酸性細胞顆粒被染成反光強的鮮紅色，膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色。高質(zhì)量的HE染色細胞核與細胞質(zhì)藍紅相映，且胞核鮮明，核膜、核仁及核染色質(zhì)顆粒均清晰可見（圖3-10-2）。圖3-10-2 HE染色：細胞質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色（400）2. PAS染色法 PAS染色法屬于特殊染色，不僅能顯示糖原，而且還能顯示中性和某些酸性黏液性物質(zhì)、軟骨、腦垂體、霉菌、脂質(zhì)、色素、淀粉樣物質(zhì)及基底膜。PAS的染色原理為：過碘酸是一種氧化劑，它能氧化糖類及有關(guān)物質(zhì)中的1,

11、 2-乙二醇基，使之變?yōu)槎?；醛與Schiff氏試劑結(jié)合生成一種品紅化合物，顯現(xiàn)為紅色。（1）Schiff氏液配制方法：將蒸餾水煮沸，冷至60，溶入堿性品紅，冷卻后過濾，至50時加鹽酸，25時加偏重亞硫酸鈉，黑暗中貯放過夜，加入活性碳，搖1 min后過濾，4暗色瓶中備用。配方為：堿性品紅1 g、偏重亞硫酸鈉2 g、1N鹽酸20 ml、活性碳2 g、蒸餾水 200 ml。（2）染色過程：切片常規(guī)脫蠟入水；1%高碘酸氧化10 min，水洗；Schiff 氏液10 min，水洗；蘇木素染核，鹽酸分化，水洗；脫水，透明，封片。（3）染色結(jié)果：糖原、基底膜及其他PAS陽性物質(zhì)均呈紅色，細胞核呈藍色（表3

12、-10-1）。腎小球基底膜、系膜基質(zhì)、包曼囊壁、腎小管基底膜陽性，淀粉樣物質(zhì)弱陽性（圖3-10-3）。3. PASM染色 組織中的粘多糖和蛋白質(zhì)與銀化合物結(jié)合后，再經(jīng)過甲醛還原成為金屬銀，沉淀于組織內(nèi)及表面，呈黑色，因此，這些物質(zhì)又稱為嗜銀性物質(zhì)（表3-10-2）。同時再套用Masson紅復(fù)染，以顯示免疫復(fù)合物的沉積。（1）六胺銀液配制（用時現(xiàn)配，硝酸銀在切片放入染缸前加入并搖勻）。配方為：預(yù)溫蒸餾水 23ml、15六次甲基四胺 6ml、5硼砂 4.5 ml、冰醋酸 1.0 ml、磷鎢酸 0.8g。PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)物質(zhì)種類舉例物質(zhì)染色結(jié)果多糖糖原強陽性糖蛋白膠原纖維、網(wǎng)狀纖維、血清白蛋白、球

13、蛋白強陽性基底膜腎小球基底膜、腎小管基底膜、包曼囊壁中等強度淀粉樣物質(zhì)淀粉樣物質(zhì)弱陽性各種色素脂褐素中等強度軟骨 軟骨強陽性霉菌曲菌強陽性表3-10-1 PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)圖3-10-3 PAS染色：腎小球系膜區(qū)基質(zhì)，腎小球毛細血管袢，包曼囊壁及腎小管基底膜呈粉紅色，細胞核呈藍色（400）（2）染色過程：切片常規(guī)脫蠟入水；3%的碘溶于100ml30%的乙醇，配制成碘乙醇，5 min脫汞，水洗；5%硫代硫酸鈉5 min脫碘，水洗；1%高碘酸氧化20 min，水洗；六胺銀液45 min（根據(jù)光鏡下染色結(jié)果確定染色時間），水洗；3%硫代硫酸鈉5 min，水洗；Masson紅復(fù)染；快速脫水，透明，封片

14、。（3）染色結(jié)果：腎小球基底膜、包曼囊壁、腎小管基底膜呈黑色，免疫復(fù)合物為紅色（圖3-10-4），本染色對觀察腎小球基底膜病變，免疫復(fù)合物的沉積非常重要，是腎活檢必不可少的染色。*圖3-10-4 PASM染色：腎小球基底膜及包囊壁呈黑色，免疫復(fù)合物呈紅色，可見內(nèi)皮下（所示）、上皮側(cè)（所示）和系膜區(qū)（*所示）嗜復(fù)紅物沉積（1000）4. Masson三色染色 用多種（3種以上）顏色顯示多種組織（結(jié)締組織）成分，用于判定各種組織、器官的病變與修復(fù)情況，以不同色調(diào)顯示與區(qū)分某些非結(jié)締組織及物質(zhì)成分。（1）Masson紅染液配制方法：變色酸2R 0.6g、蒸餾水 100 ml、亮綠0.3 g、冰醋酸

15、1.0 ml、磷鎢酸 0.8 g。（2）染色過程：切片常規(guī)脫蠟入水；蘇木素染核5 min，鹽酸分化，水洗；Masson紅30 秒，水洗；0.5%亮綠30秒；快速脫水，透明，封片。（3）染色結(jié)果：膠原纖維呈綠色，免疫復(fù)合物呈紅色，纖維素呈紅色（圖3-10-5，表3-10-3）。*g圖3-10-5 Masson三色染色：腎小球基底膜，包囊壁呈藍色，免疫復(fù)合物呈紅色，可見內(nèi)皮下（所示）、上皮側(cè)（所示）和系膜區(qū)（*所示）（400）5. 剛果紅染色 剛果紅是一種分子為長線狀的偶氮染色劑，以胺基和淀粉樣物質(zhì)的羥基結(jié)合，平行的附著在淀粉樣纖維上，從而使淀粉樣物質(zhì)被染成橙紅色。（1）剛果紅染液配制方法：1Na

16、OH 0.3 ml、80乙醇氯化鈉剛果紅飽和溶液 30 ml。PASM染色反應(yīng)陽性物質(zhì)物質(zhì)種類染色結(jié)果各種基底膜：腎小球基底膜、包曼囊壁和腎小管基底膜強陽性：黑色系膜基質(zhì)強陽性：黑色免疫復(fù)合物紅色淀粉樣物質(zhì)不嗜銀表3-10-2 PASM染色反應(yīng)陽性物質(zhì)Masson三色染色反應(yīng)陽性物質(zhì)物質(zhì)種類染色結(jié)果各種基底膜：腎小球基底膜、包曼囊壁和腎小管基底膜強陽性：藍綠色系膜基質(zhì)強陽性：藍綠色免疫復(fù)合物紅色淀粉樣物質(zhì)淡染的藍綠色膠原及纖維組織藍綠色表3-10-3 Masson三色染色反應(yīng)陽性物質(zhì)（2）染色過程：切片常規(guī)脫蠟入水（切片厚度5 mm）；蘇木素染核，分化，水洗；堿性剛果紅液20 min；快速脫水

17、，透明，封片。（3）染色結(jié)果：淀粉樣物質(zhì)呈橙紅色，細胞核呈藍色（圖3-10-6a）。6. 高錳酸鉀-堿性剛果紅染色 步驟同剛果紅染色，在染剛果紅之前，用高錳酸鉀處理后，AA型淀粉樣物質(zhì)被降解，再行剛果紅染色，不著色，為陰性，以區(qū)分AA型和非AA型淀粉樣變性。（1）染色過程：切片常規(guī)脫蠟入水（切片厚度5 mm）；高錳酸鉀-硫酸液3 min，水洗；5%草酸漂白3 min，水洗；蘇木素染核，分化，水洗；堿性剛果紅液20 min；快速脫水，透明，封片。（2）染色結(jié)果：淀粉樣物質(zhì)呈橙紅色，細胞核呈藍色（圖3-10-6b）。（四）各種染色過程注意事項常規(guī)脫蠟要徹底；每次染色前雙層濾紙過濾蘇木素；Schif

18、f氏液要4C保存；PASM-Masson染色標本缸要干凈、無水滴，切片要求90C烤30 min，顯微鏡下控制染色深淺；剛果紅染色切片厚度要求5 mm。ab圖3-10-6 a：剛果紅染色，腎小球系膜區(qū)，部分腎小管基底膜呈磚紅色（400）；b：高錳酸鉀剛果紅染色，經(jīng)高錳酸鉀處理后，非AA型淀粉樣變性剛果紅染色仍陽性（400）三、免疫病理標本的制作3, 4 免疫病理所采用的標本可用石蠟和冰凍切片，冰凍切片的腎組織新鮮，抗原保存好，并能在70C冰箱保存使用。石蠟切片的制備同光鏡標本。下面主要介紹冰凍切片的制備。（一）冰凍標本的制備腎活檢取材用于制備冰凍切片的標本，應(yīng)放在預(yù)先用TRIS或PBS溶液濕潤的

19、干凈紗布上，連同紗布放入清潔的玻璃小瓶或培養(yǎng)皿中，迅速放入冰桶中送實驗室進行冰凍切片，避免直接放于冰塊上，以免局部組織凍壞。也可采用速凍方法進行準備。組織速凍方法分液氮法和干冰-丙酮法。液氮法：將腎活檢后切取組織放入預(yù)先準備好的小容器中，緩慢放入液氮中，待組織接觸液氮開始氣化后，組織迅速冷凍形成冰塊，取出后在液氮中送實驗室進行冰凍切片，如不及時切片，也可放入液氮中或70C冰箱中保存。干冰-丙酮法：準備好內(nèi)放有OCT（Optimal cutting temperature，OCT）包埋劑的標本盒，將組織塊完全浸沒即可。向裝有干冰的保溫杯內(nèi)加入丙酮，調(diào)成糊狀，將標本盒放入干冰中，待包埋劑變成白色凍

20、塊時，取出保存或切片同液氮法。進行組織速凍時須注意，組織不能直接放入液氮，以免組織膨脹破碎，速凍用的包埋劑應(yīng)適量，新鮮組織不能緩慢冷卻，否則形成冰晶，造成組織結(jié)構(gòu)破壞，冷凍后的組織應(yīng)密封保存，否則會失水，組織塊復(fù)溫時，應(yīng)在37C加溫速融，不能自然復(fù)溫，否則造成組織結(jié)構(gòu)破壞9。（二）冰凍切片將腎組織置于恒溫冷凍切片機的冷凍頭上，加少許OCT進行包埋，在20C下進行連續(xù)切片，切片厚度為34 m，一般切取20張，用于常規(guī)免疫病理（包括免疫熒光法和免疫組織化學法）及放入20C冰箱備用。（三）免疫熒光法1. 直接法 用熒光素標記的抗體與腎組織直接作用，在熒光顯微鏡下觀察，以達到檢測目的（圖3-10-7）

21、。常用于直接法檢測的熒光抗體包括：抗IgG、IgA、IgM、C3、C4和C1q抗體10。具體步驟：冰凍切片用10%小牛血清封閉（PBS稀釋）；去除多余液體，加稀釋好的抗體，避光，濕盒內(nèi)室溫孵育40 min；流水沖洗，置75%乙醇1 min，無水乙醇1 min，吹干；甘油封片，熒光顯微鏡觀察。免疫熒光直接法和間接法示意圖直接法間接法熒光標記抗體熒光標記第二抗體第一抗體組織切片圖3-10-7免疫熒光直接法和間接法示意圖2. 間接法 用特異性抗體（一抗，未標記熒光）與腎組織結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，再用針對一抗的標記熒光素的二抗與上述抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，發(fā)出熒光，在熒

22、光顯微鏡下觀察。間接法較直接法敏感510倍，而且只需一種標記的熒光抗體（圖3-10-8）。常用間接法檢測的熒光抗體包括免疫球蛋白輕鏈，載脂蛋白A、E（Apo A,Apo E），乙肝抗原，腎組織IV型膠原等10。具體步驟：冰凍切片如已干燥，可直接染色（如從低溫冰箱取出的冰凍切片，須充分吹干）；10%小牛血清封閉（PBS稀釋）；去除多余液體，加稀釋好的抗體后，避光，室溫1.5 h；PBS沖洗3次；加熒光標記的第二抗體，避光，置室溫40 min，水洗；吹干，甘油封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。ab圖3-10-8a：直接法，IgG沿腎小球毛細血管袢分布；b：間接法，腎小球毛細血管袢內(nèi)Apo E陽性（四）免疫

23、酶標技術(shù)免疫酶標技術(shù)（immunoenzymatic technique）是指用酶標記抗體或酶標記抗抗體進行的抗原抗體反應(yīng)，其原理及操作程序與免疫熒光技術(shù)基本相似，差別在于用酶代替熒光素作為標記物，并以底物被酶分解后的顯色深淺來反映組織中抗原或抗體的含量及位置，常用的酶為辣根過氧化物酶（horseradish peroxidese，HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatese，AKP），常用的顯色劑 有DAB（3,3-二氨基聯(lián)苯胺）和AEC（3-氨基-9-乙基卡巴唑），前者為棕色（圖3-10-9a），可長期保存，后者為紅色（圖3-10-9b），易于褪色。免疫酶技術(shù)用于正常和病

24、理組織中，稱為酶免疫組織化學技術(shù)。優(yōu)點為：可用普通光學顯微鏡觀察，酶標記抗體染色后，標本還可用其他染料復(fù)染，以顯示細胞形態(tài)或細胞核，標本可長期保存。最常用的是過氧化物酶-抗過氧化物酶法，簡稱PAP法，此外還有生物素和親和素（ABC）法。免疫酶標技術(shù)分為間接法和直接法，其原理同免疫熒光直接法和間接法12。下面分別介紹其步驟。ab圖3-10-9免疫酶標染色a：胰島Amylin染色，DAB顯色為棕色；b：腎組織Cytokeratin染色，AEC顯色為紅色1. 直接法 標本固定，冰凍切片已干燥，可直接染色（如從低溫冰箱取出的冰凍切片，須充分吹干），石蠟切片脫蠟、入水；PBS洗滌23 min； 3.1

25、H2O2（或1 H2O2 甲醇）抑制內(nèi)源性過氧化物，室溫1020 min；正常血清（1 : 10）孵育，室溫20 min；滴加酶標記的抗體371 h或4過夜；PBS洗滌33 min；DABH2O2顯色510 min，鏡下控制染色結(jié)果。DABH2O2應(yīng)用前15 min配制；充分水洗后，復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。2. 間接法 標本固定，冰凍切片已干燥，可直接染色（如從低溫冰箱取出的冰凍切片，須充分吹干），石蠟切片脫蠟、入水；PBS洗滌23 min；1H2O2（或1H2O2 甲醇）抑制內(nèi)源性過氧化物，室溫1020 min；正常血清（1 : 10）孵育，室溫20 min；滴加第一抗體，371 h或

26、4過夜；PBS洗滌33 min；滴加酶標二抗，室溫1 h；PBS洗滌33 min；0.04DAB0.03 H2O2顯色510 min；充分水洗后，復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。3. 單PAP法 標定固定后，PBS洗滌；1H2O2（或1H2O2 甲醇）阻斷內(nèi)源性過氧化物，室溫1020 min；PBS洗滌23 min；正常血清（二抗的正常血清）孵育，室溫20 min；滴加一抗，室溫1 h或4過夜；PBS洗滌33 min；滴加二抗，室溫30 min；PBS洗滌33 min；加PAP復(fù)合物，室溫60 min；PBS洗滌33 min；0.04DAB0.03 H2O2顯色510 min（圖3-10-9）；

27、充分水洗； 蘇木素復(fù)染，封片觀察。4. PAP四層法（圖3-10-10）：同單PAP法；二次加酶標二抗；PBS沖洗；二次加PAP；PBS沖洗；0.04DAB0.03 H2O2顯色510 min；蘇木素復(fù)染核，封片，鏡檢。5. 生物素和親和素法（ABC法） 標定固定后，PBS洗滌；1H2O2（或1H2O2 甲醇）阻斷內(nèi)源性過氧化物，室溫1020 min；PBS洗滌23 min；正常血清（二抗的正常血清）孵育，室溫20 min；滴加一抗，室溫1 h或4過夜；PBS洗滌33 min；滴加二抗，室溫30 min；PBS洗滌33 min；加ABC液，室溫60 min；PBS洗；0.04DAB0.03 H

28、2O2顯色510 min（圖3-10-11）；充分水洗；蘇木素復(fù)染核，封片，鏡檢。過氧化物酶抗過氧化物酶抗體復(fù)合物四層法圖3-10-10 過氧化物酶抗過氧化物酶抗體復(fù)合物四層法生物素和親和素法（ABC法）圖3-10-11 生物素和親和素法（ABC法）四、電鏡標本的制備 許多腎臟疾病必須依靠電子顯微鏡觀察腎小球基底膜、電子致密物的沉積部位，沉積物的特點以及細胞器等超微結(jié)構(gòu)的變化來明確診斷。電鏡標本的制作過程與石蠟切片相似，也包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個環(huán)節(jié)1215。而與石蠟切片不同的是，電鏡標本的制備操作過程更為細致與復(fù)雜，要求更為嚴格，而且所用的試劑及配方也不盡相同

29、。（一）取材取材是電鏡標本制備的第一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。取材是否正確與制備出來的樣品能否符合觀察要求直接相關(guān)。由于生物體內(nèi)代謝非常迅速，生物組織離體后，細胞將會釋放出各種水解酶引起細胞自溶，細胞內(nèi)部發(fā)生微細的結(jié)構(gòu)變化。這些微細的改變在光鏡下也許無法察覺，在電鏡下則會呈現(xiàn)為明顯的變化。因此，取材應(yīng)注意以下幾點：在冷板上分離切取組織，動作應(yīng)迅速，盡快使組織浸入4C固定液中，從而最大程度地保存組織在生活狀態(tài)時的結(jié)構(gòu)；組織塊大小不超過1 mm3； 取樣時所用的器具必須干凈，刀、剪等必須鋒利，在操作時盡量避免拉、鋸、壓等動作對組織細胞造成的機械損傷；腎活檢超微結(jié)構(gòu)觀察主要是腎小球，應(yīng)取腎皮質(zhì)部位的組織，含腎小球

30、13個，因組織塊不能太大，應(yīng)取34塊，以避免未取到腎小球，影響觀察。（二）固定、脫水和包埋固定是制樣過程中最關(guān)鍵的一步。它的失敗將導(dǎo)致整個制樣過程的后續(xù)步驟完全無效。固定是終止組織細胞的生化過程，同時把它們的超微結(jié)構(gòu)改變控制在最小范圍內(nèi)，并保護這些結(jié)構(gòu)在后續(xù)的脫水、包埋等過程中不被破壞?？晒┻x擇使用的固定劑種類和固定方法及方式很多，它們各自有其優(yōu)缺點。判斷固定良好的標準見表3-10-4。目前腎活檢組織常用的固定方法是化學固定法，浸泡方式固定，采用戊二醛和四氧化鋨雙重固定。1. 常用的固定劑和包埋劑（1）戊二醛（glutaraldehyde）：戊二醛是一種五碳醛，含有兩個醛基。分子式為C5H8O

31、2，分子量為100。電鏡固定通常采用電鏡專用的25戊二醛水溶液稀釋成需要的濃度。其pH為4.05.0。氧氣、高溫、中性或堿性pH均能使戊二醛發(fā)生聚合失去醛基，并降低交聯(lián)效力，所以平時這種原液應(yīng)在低溫保存。此外，戊二醛存放時間過長時，pH值會降低，顏色變黃，固定效力也大大降低，若戊二醛pH值降至3.5以下或含有其他雜質(zhì)時，必須純化后才能使用。戊二醛對皮膚有硬化作用，但它的揮發(fā)性較甲醛弱，最好能在通風櫥中操作。 戊二醛優(yōu)點：在固定劑中它與蛋白質(zhì)的交聯(lián)能力最好，也能固定糖原和核酸，對細胞內(nèi)的微管和一些酶的活性保存較好，是保存精細結(jié)構(gòu)最好的醛；反應(yīng)速度快，是優(yōu)良的前固定劑，滲透速度比四氧化鋨快；能彌補

32、四氧化鋨的不足，對糖原、核酸，尤其是對微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞基質(zhì)固定效果較好；戊二醛前固定的樣品不易變脆，可以長時間固定（但最好不要超過1個星期），因而適用于遠離實驗室或野外現(xiàn)場取材。但戊二醛在稀釋溶液中會自行發(fā)生一系列反應(yīng)，因而固定液應(yīng)盡可能新鮮配制，配制好的固定液和戊二醛前固定后的樣品應(yīng)在4下儲存。戊二醛的缺點：它不能固定脂質(zhì)，致其在以后的脫水過程中被有機溶劑溶去，不宜作單獨的固定劑使用。無法提供高反差，需與四氧化鋨同時進行前后固定，相互彌補不足。戊二醛固定不影響細胞的滲透性，對緩沖液和滲透壓要求較高。（2）四氧化鋨（Osmium tetroxide）：四氧化鋨是一種很強的氧化劑，呈淺黃色結(jié)晶

33、，其分子式OsO4，分子量254，熔點41，沸點131，飽和水溶液的濃度為7.24（25），它的水溶液為中性，有極大毒性。商品化產(chǎn)品有密封的四氧化鋨晶體和2%的四氧化鋨水溶液兩種。四氧化鋨晶體溶于水的速度很慢，必要時可以使用超聲波設(shè)備來加速溶解。配制好的2四氧化鋨水溶液使用方便，較常使用。但要特別注意的是無論是四氧化鋨晶體還是水溶液都會揮發(fā)出四氧化鋨氣體，即使在0時也有四氧化鋨氣體釋放，因此，應(yīng)將四氧化鋨置于密閉容器（玻璃容器）中保存。四氧化鋨氣體對呼吸系統(tǒng)有刺激，對眼睛有嚴重的破壞作用，因此，在使用時應(yīng)特別小心，盡可能在通風櫥中進行，并且嚴格控制用量。廢棄的四氧化鋨溶液應(yīng)加入乙醇水溶液或硫酸

34、亞鐵溶液，使四氧化鋨轉(zhuǎn)化為黑色沉淀，以降低毒性，方便收集處理。判斷電鏡標本固定良好的標準部位標準細胞膜低倍下呈完整清晰的單層結(jié)構(gòu)，高倍下見雙層結(jié)構(gòu)核膜內(nèi)外膜完整，基本平行，可見核孔線粒體飽滿，外膜完整光滑，內(nèi)嵴連續(xù)，內(nèi)、外膜間保持一定距離，沒有腫脹或收縮粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池完整，膜上核糖體可辨，沒有脫落或丟失滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈分枝小管狀或泡狀，膜完整高爾基復(fù)合體扁平囊成堆疊排列，膜完整核內(nèi)含物核仁、核液及染色質(zhì)保存完好，并層次清楚可辨糖原顆粒致密，保存良好，沒有丟失細胞質(zhì)基質(zhì)呈精細顆粒狀，分布均勻，未見明顯的空白區(qū)表3-10-4判斷電鏡標本固定良好的標準四氧化鋨固定劑的優(yōu)點： 四氧化鋨可以與脂類、糖類

35、和蛋白質(zhì)反應(yīng)。對脂類的固定作用可以補充醛類固定劑對脂類固定不足的缺點；能增加膜的反差，起到電子染色作用，使被固定的樣品圖像有較好的反差。 四氧化鋨會破壞大部分細胞膜的半透膜特性，配制四氧化鋨固定液對緩沖液的要求不高 。四氧化鋨的缺點： 四氧化鋨滲透力弱，要求組織塊要小，否則組織內(nèi)部自溶過程繼續(xù)進行，引起組織塊內(nèi)部固定不好。 不能保存糖原，也不能有效固定核酸，而且對微管固定效果也不理想。四氧化鋨能與乙醇或醛類起氧化-還原反應(yīng)，生成沉淀。所以，醛類處理過的樣品轉(zhuǎn)入四氧化鋨固定前或四氧化鋨固定后轉(zhuǎn)入乙醇溶液脫水前都必須用相應(yīng)的緩沖液充分漂洗干凈。四氧化鋨具有揮發(fā)性，對黏膜有毒性作用。（3）Epon8

36、12包埋劑：Epon812是目前國際上普遍采用的一種優(yōu)良包埋劑，一種長鏈的脂肪族環(huán)氧化合物，黏度為150210cP（在25）。該包埋劑的配制方法很多，但一般都按1961年Luft提出的配方進行。其配方如下：A液：Epon812 62 ml、DDSA（十二烷基琥珀酸酐） 100 ml；B液：Epon812 100 ml、MNA（甲基內(nèi)次甲基四氫鄰苯二甲酸酐）89 ml。改變A液和B液的比例則可調(diào)節(jié)聚合塊硬度，A液多則軟，B液多則硬。通常冬天時A : B=2 : 8；夏天時A : B=1 : 9，可視組織的硬度和氣候不同調(diào)節(jié)其比例。2. 組織處理過程 將活檢標本切為0.51 mm3左右的小塊，放入

37、4C 的2%4%的戊二醛固定液，或者2%的多聚甲醛+2%或2.5%的戊二醛混合固定液中，4下固定24 h或更長。4下用0.1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液充分漂洗組織一晝夜，中間換液5-8次，最好每12 h換液1次。4下用臨時配制的1%鋨酸固定液再固定1.52 h。0.1 mmol/L的磷酸鹽組緩沖液充分漂洗組織10 min，再用丙酮或乙醇逐級（一般30%、50%、70%、90%）脫水，每級1015 min，但純丙酮或純乙醇中脫水2030 min共 2次。將脫水后的標本移入包理劑（已預(yù)先配好）與純丙酮1：1的配制液中浸透30 min以上，再移入2 : 1的配制液中3 h，入純包理劑3 h 。預(yù)先

38、烤干的2號藥用膠囊（內(nèi)放標本號）注入包埋劑八成滿，再放樣品于膠囊中央，待樣品沉到膠囊底部后移入烤箱，371224 h，4512 h，601224 h聚合。3. 修塊與定位 在進行超薄切片前，首先必須對包埋塊進行修整。修塊的目的便于連續(xù)切片。修整可以用雙面或單面刀片手工修整，將已聚合好的樹脂包埋塊放入專用的樣品夾中，在解剖顯微鏡下用單面刀片修去頂端和多余的包埋介質(zhì)，把要觀察的部分修成錐體，并將頂端的平面修成邊界明顯的平整梯形或方形。由于超微結(jié)構(gòu)觀察的部位很小，為了便于尋找要觀察的部位，超薄切片前要進行定位。將修好的包埋塊置于超薄切片或修塊機上進行半薄切片（0.52 mm）。半薄切片的觀察須借助染

39、色，染色前不必去除包埋劑，常用的染色方法有1%的甲苯胺藍染液、姬姆薩染液、或甲基藍-堿性復(fù)紅。甲苯胺藍染色的具體步驟如下：0.5-1mm半薄切片撈于載玻片上，0.5-1%的甲苯胺藍水溶液置于50-60C溫箱內(nèi)浸染5分鐘，蒸餾水稍洗，中性樹脂封片，鏡下觀察。根據(jù)定位結(jié)果，腎活檢主要觀察腎小球，進一步修好包埋塊，保留12個腎小球，或所需觀察的腎小管間質(zhì)或其他部位，把其他部分削去后進行超薄切片。在此需要強調(diào)，甲苯胺藍染色除用于半薄切片的定位，在Fabry病的診斷中具有重要意義，可見足細胞胞漿中甲苯胺藍染色陽性的顆粒狀物質(zhì)，少數(shù)見于腎小管上皮細胞、動脈及管周毛細血管內(nèi)皮細胞胞漿中（圖3-10-12）。

40、圖3-10-12 甲苯胺藍染色，足細胞胞質(zhì)內(nèi)見陽性顆粒（400）4. 超薄切片 在超薄切片機上用玻璃刀或鉆石刀進行超薄切片，厚度為7090 nm。再用預(yù)先覆有支持膜或無支持膜的銅網(wǎng)、鎳網(wǎng)撈取超薄切片晾干，以備染色。5. 超薄切片染色 電鏡所用的光源是電子束，電鏡圖像的反差是樣品中不同物質(zhì)對電子束不同散射能力差異所形成的。散射的電子數(shù)越多，圖像越暗，反之，散射的電子數(shù)越少，圖像越亮。超薄切片染色是利用重金屬離子對不同細胞結(jié)構(gòu)的結(jié)合能力不同，使細胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)對電子束的散射能力不同，從而造成反差。目前常用的為鈾和鉛雙重染色，先染鈾再染鉛，具體染色方法有多種。傳統(tǒng)的醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染法具體步驟如下：

41、在預(yù)先制作好的蠟板上滴加醋酸鈾染液，將撈有切片的銅網(wǎng)覆于染液上1530 min，期間加蓋，放于暗處。用雙蒸水沖洗、吸干。從醋酸鈾染液中取出銅網(wǎng)，用雙蒸水沖洗、吸干。在蠟板上放置少許氫氧化鈉固體，在其旁邊滴加檸檬酸鉛染液。注意避免檸檬酸鉛染液與氫氧化鈉固體接觸。把載有切片的銅網(wǎng)覆于染液上510 min。注意放置銅網(wǎng)時不要對著檸檬酸鉛染液呼氣，且盡快放置好銅網(wǎng)并加蓋。當需要染色的銅網(wǎng)數(shù)量較多時，可以在一塊干凈的橡膠上切割數(shù)條短裂縫，把銅網(wǎng)逐個直立夾在裂縫中，并將橡膠放置于干凈的培養(yǎng)皿中，將醋酸鈾染液小心地滴在銅網(wǎng)貼有切片的一面，使其充分接觸，1530 min后，將橡膠取出。用雙蒸水沖洗，將銅網(wǎng)上的

42、水吸干。充分干燥后，將染色好的銅網(wǎng)放入透射電子顯微鏡中觀察（圖3-10-13）。五、免疫電鏡技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)是免疫化學技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是在超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原、抗體結(jié)合定位的一種方法。主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術(shù)，即采用抗原抗體凝集反應(yīng)后，再經(jīng)負染色直接在電鏡下觀察；另一類則是免疫電鏡定位技術(shù)。該項技術(shù)是利用帶有特殊標記的抗體與相應(yīng)抗原相結(jié)合，在電鏡下觀察，由于標準物形成一定的電子密度而提示出相應(yīng)抗原所在的部位。免疫電鏡的應(yīng)用，使得抗原和抗體定位的研究進入亞細胞的水平。本章主要介紹后者。（一）取材和固定為了既能將抗原準確定位甚至定量，又能觀察到近似于生理狀態(tài)下的細胞

43、超微結(jié)構(gòu)，必須選擇合適的固定劑，取組織塊時做到越快越好。常用的固定方式有以下兩種。灌注固定：效果最好，能夠很好保存超微結(jié)構(gòu)。但只適用于動物實驗，不適宜人腎活檢標本。 浸沒固定：將手術(shù)、腎活檢取材或灌注后切成的標本塊浸沒在固定液中固定，組織塊浸沒固定時間常為25 h，游離細胞固定0.51 h。目前常用的固定劑有：4%多聚甲醛、1.5%2%戊二醛、1%多聚甲醛1%戊二醛、4%多聚甲醛0.5%苦味酸0.25%戊二醛、96%乙醇1%醋酸。不論采用何種固定劑，使用前必須用已知效價的抗原做一系列預(yù)實驗。確定固定劑的種類、濃度、溫度、pH值及固定時間等以達到最佳固定效果。（二）包埋劑的選擇免疫電鏡的包埋劑類

44、型包括環(huán)氧樹脂包埋劑和低溫包埋劑。根據(jù)免疫標記的時間不同，應(yīng)選擇不同的包埋劑。ab圖3-10-13腎組織超薄切片鈾-鉛雙重染色a：腎小球基底膜內(nèi)皮下及系膜區(qū)大量團塊高密度電子致密物分布；b：正常線粒體包埋前免疫標記：對已固定的樣品先進行免疫標記，然后進行包埋、超薄切片并觀察，一般選用環(huán)氧樹脂包埋劑。環(huán)氧樹脂具疏水性，在包埋前樣品必須先完全脫水，然后在溫箱中熱聚合。熱聚合會使大多數(shù)抗原變性，因此，該包埋劑不適用于包埋后免疫標記。 包埋后免疫標記：指組織標本經(jīng)固定及樹脂包埋，制作成超薄切片后再進行免疫化學標記的方法，此方法多用低溫包埋劑，如Lowicryl系列包埋劑、LR White包埋劑和LRG

45、old包埋劑。這3種包埋劑均能在低溫下（35-80）用紫外光（波長315360 nm）進行聚合，避免高溫對抗原性的負面影響，提高了陽性標記率，而且對膠體金的非特異性吸附少，對溫度敏感的抗原應(yīng)選擇使用低溫包埋劑。（三）免疫標記及染色根據(jù)免疫標記與標本包埋之間的不同關(guān)系，分為包埋前免疫標記、包埋后免疫標記和不用包埋的冷凍超薄切片免疫標記。根據(jù)具體的標本、抗原的部位及性質(zhì)并結(jié)合實驗室的具體條件選擇適當?shù)姆椒?。三者均包括非特異性位點的封閉、抗體與抗原特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)、反應(yīng)部位的示蹤顯示等基本步驟。包埋前免疫標記主要用于細胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脫水劑和樹脂成分溶解和變性的抗原檢測。

46、包埋后免疫標記具有超微結(jié)構(gòu)保存較好、方法簡便可靠、陽性結(jié)果重復(fù)性好的優(yōu)點，并可對同一組織塊的連續(xù)切片做各種對照免疫標記，能十分準確地解釋免疫標記結(jié)果，而且還能在同一張切片上進行多重免疫標記，尤其適合于顆粒性標記物（膠體金標記）的免疫化學定位標記，是目前應(yīng)用最廣的免疫電鏡技術(shù)。但是該方法也有明顯的缺點，抗原在脫水、浸透及樹脂包埋過程中可能被破壞，且抗原被樹脂遮蓋，不易與抗體接觸，使免疫標記的陽性率下降。尤其是后固定劑鋨酸對抗原的破壞較嚴重，限制了在臨床應(yīng)用。包埋前和包埋后免疫電鏡的超薄切片同常規(guī)電鏡，但免疫電鏡用載網(wǎng)要選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)，而不用銅網(wǎng)，因銅網(wǎng)會與某些化學物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，影響標記結(jié)果。 冷

47、凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)的特點是組織不經(jīng)脫水包埋直接冷凍，在冷凍狀態(tài)下進行超薄切片，然后進行免疫標記。該項技術(shù)克服了上述兩種方法的缺點，能更理想地保存一些生物大分子的活性，極大地提高了免疫標記的敏感性，隨著冷凍超薄切片技術(shù)的不斷改進，該項技術(shù)更加完美，應(yīng)用也越來越廣泛。但該項技術(shù)必須有特殊的冷凍超薄切片機，實際操作難度較高。標記染色法分為直接染色法與間接染色法兩種。前者的特點是特異性較高，敏感性低，標記抗體只能用于檢測一種抗原。后者敏感性較強，一種標記抗體可用于多種抗原的檢測，缺點是特異性較差。標記物采用膠體金標記的抗體，可以自備或購買膠體金標記好的抗體，一般膠體金的直徑為5、10、15或20 nm（圖3-10-14），可根據(jù)實際需要選擇。下面介紹常用的包埋后免疫電鏡技術(shù)的間接免疫標記和染色步驟。超薄切片室溫下1%H2O2蝕刻10 min左右；雙蒸水沖洗切片35次；用含1%小牛血清的PBS孵育15 min；PBS沖洗切片5次；用適當稀釋的一抗室溫孵育12 h。一抗用含1%小牛血清的PBS稀釋；漂洗同步驟4；室溫下用適當稀釋的膠體金探針孵育30 min；漂洗同步驟4；雙蒸水沖洗切片；常規(guī)醋酸鈾和硝酸鉛染色后在透射電鏡下觀察。為了證實免疫標記結(jié)果的特異性，必須同時進行對照實驗： 用未經(jīng)免疫的同種動物正