流式細(xì)胞儀的使用程序VIP

1、流式細(xì)胞儀的使用程序血液病實(shí)驗(yàn)診斷中心一.開(kāi)機(jī)程序1. 檢查穩(wěn)壓器電源，打開(kāi)電源，穩(wěn)定5分鐘。2. 打開(kāi)儲(chǔ)液箱，倒掉廢液，并在廢液桶中加入400ml漂口水原液。打開(kāi)壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水,做分選必須用PBS或FACSFlow),合上壓力閥。確實(shí)蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。3. 將FACSCalibur開(kāi)關(guān)打開(kāi)，此時(shí)儀器功能控制鈕的顯示應(yīng)是STANDB河熱5-10分鐘。排出過(guò)濾器內(nèi)的氣泡。4. 如果需要打印，打開(kāi)打印機(jī)電源。5. 打開(kāi)電腦,等待屏幕顯示出標(biāo)準(zhǔn)的蘋(píng)果標(biāo)志。6. 執(zhí)行儀器PRIM或能一次，以排除Flowcell中的氣泡。7. 分析樣品時(shí)，先用

2、FACAFlowlgPBS進(jìn)彳fHIGHRUN勺2分鐘。做過(guò)分選后,每次開(kāi)機(jī)后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個(gè)50ml離心管，不接通濃縮系統(tǒng)，趣下右下角口色按鈕開(kāi)始沖洗。待自動(dòng)停止后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。二?預(yù)設(shè)獲取模式文件(AcquisitionTemplateFi.les)1 .從蘋(píng)果標(biāo)志中選擇CELLQuest見(jiàn)一個(gè)新視窗，可利用此視窗編輯一個(gè)獲取模式文件。2. 選取屏幕左列繪圖工具中的Dotplot,繪出一個(gè)或多個(gè)DotPlots（點(diǎn)圖）。從DotPlot對(duì)話框中選取Acquisition作為圖形資料來(lái)源，并確定適當(dāng)?shù)膞軸和y軸參數(shù)。3. 選取屏幕左列繪圖工具中的Histogr

3、am,同上法可繪出Histogram（直方圖）。4. 將此視窗命名后儲(chǔ)存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夾中，下次進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)時(shí)可直接調(diào)用。.本計(jì)算機(jī)中已設(shè)定兩個(gè)模式文件：ACQF口EXP,儲(chǔ)存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夾中，ACQffi于細(xì)胞DA檢測(cè)，EXP用于細(xì)胞表面標(biāo)志分析。三.用CELLQuest進(jìn)行儀器的設(shè)定和調(diào)整1. 從蘋(píng)果畫(huà)面中選取CELLQuest,進(jìn)入CELLQues詬在File指令欄中打開(kāi)合適的獲取模式文件。2. 從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Con

4、necttoCytometer（快捷鍵：+B）進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的AcquisitonControl對(duì)話框移至合適位置。3. 從Cytometer指令欄中，開(kāi)啟Detectors/Amps>Threshold、CompensationStatus等四個(gè)對(duì)話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數(shù)據(jù)時(shí)隨時(shí)調(diào)整獲取件。也可以用+1,2,3,4獲得此四個(gè)對(duì)話框。4. 在Detectors/Amps對(duì)話框中，先為每個(gè)參數(shù)選擇適'"|的倍增模式（amplifiermode:線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log。一般進(jìn)行細(xì)胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細(xì)胞亞群時(shí)，F(xiàn)SG口SSC多

5、以線t模式Lin測(cè)且DDMParam選擇FL2,而FL1,FL2與FL3貝U以對(duì)數(shù)模式Log測(cè)M;分析細(xì)胞DNAM時(shí)，F(xiàn)SC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin進(jìn)行測(cè)量，且DDMParang擇FL2;分析血小板表型時(shí),FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log進(jìn)行測(cè)量。5. 放上待檢測(cè)的樣品，將流式細(xì)胞儀設(shè)定于RUN流速可在HIGH或LOWK6. 在AcquisitonControl對(duì)話框中，選取Acquire,開(kāi)始獲取細(xì)胞。在以下的儀器調(diào)整過(guò)程中隨時(shí)選取Pause,Restart以觀察調(diào)整效果。未完全調(diào)整好之前不要去掉SETUPO勺。7. 在Detectors/Amps對(duì)話框中

6、，調(diào)整FSCmSSCB測(cè)器中的信號(hào)倍增度：PMTvoltages（粗調(diào)）與AmpGains（細(xì)調(diào)），使樣品信號(hào)出現(xiàn)在FSC-SSC（圖內(nèi),且三群細(xì)胞合理分布。8. 在Threshold對(duì)話框中選擇適當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)定Threshold,并調(diào)整Threshold的高低，以減少噪音信號(hào)（細(xì)胞碎片）。一般做細(xì)胞表型時(shí)用FSC-H而做DNA寸用FL2-HoThreshold并不影響檢測(cè)器對(duì)信號(hào)的獲取，但可改善畫(huà)面質(zhì)io9. 從屏幕左列繪圖工具中選取Region（區(qū)域），并在靶細(xì)胞周圍設(shè)定區(qū)域線，即通常所說(shuō)的門(mén)。圈定合適的細(xì)胞群可使儀器調(diào)整更為容易。10. 在Detectors/Amps對(duì)話框中，調(diào)整熒光檢測(cè)

7、器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對(duì)照樣品調(diào)整細(xì)胞群，使之分布在正確的區(qū)域內(nèi)。11. 在Compensation對(duì)話框中，根據(jù)所用的調(diào)補(bǔ)償用標(biāo)準(zhǔn)熒光樣品調(diào)整雙色（或多色）熒光染色所需的熒光補(bǔ)償。比如應(yīng)該為FL1+FL2-的細(xì)胞群卻分布在FL1+FL2越域內(nèi)，則需調(diào)大FL2-?%FL1中的“？”，并從FL1-FL2點(diǎn)圖中觀察新的調(diào)整是否恰當(dāng)12. 在Status對(duì)話框中可見(jiàn):LaserPower:正常值一Run/Ready為14.7mW,Standby為5mW;Lasercurrent:正常值為6Amps左右。13. 調(diào)整好的儀器設(shè)定可在InstrumentSe

8、ttings對(duì)話框中儲(chǔ)存，下次進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)時(shí)可調(diào)出使用，屆時(shí)只需微調(diào)即可。2. 本計(jì)算機(jī)中已有三個(gè)名叫儲(chǔ)存于CELLQuest Folder IMMInstrSettingsSettings Files CalibFile Mast-Cell-Set胞，后者用于分析小鼠肥大細(xì)胞。FACStation G3 BD Applications及 FACStation G3 BD Files Instrument的參數(shù)文件，前二者可用于分析人白細(xì).通過(guò)預(yù)設(shè)的獲取模式文件進(jìn)行樣品分析1. 從蘋(píng)果標(biāo)志中選擇CELLQUES新視窗出現(xiàn)后從File指令欄中選擇Open,2. 從屏幕上方Acquire指令欄中，

9、選取ConnecttoCytometer進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的AcquisitonControl對(duì)話框移至合適位置。3. 從Cytometer指令欄中選取InstrumentSettings,在其對(duì)話框中選擇Open以調(diào)出以前存儲(chǔ)的相同實(shí)驗(yàn)的儀器設(shè)定，按Set確定。4. 在Acquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲(chǔ)存的細(xì)胞數(shù)，參數(shù)，信號(hào)道數(shù)。其中Resolution在做細(xì)胞表面標(biāo)志時(shí)選擇256，做DNA寸選擇1024。ParameterSaved則根據(jù)不同的檢測(cè)對(duì)象選擇不同的參數(shù)。5. 在Acquire指令欄中，選擇ParameterDescrip

10、tion,以決定文件存儲(chǔ)位置(folder),文件名稱(file)，樣品代號(hào)以及各種參數(shù)的標(biāo)記(panel),即安排tubel,2,3的檢測(cè)參數(shù)。一般本儀器獲取的數(shù)據(jù)按照檢測(cè)對(duì)象的不同分別儲(chǔ)存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DA文件夾中。文件根據(jù)日期命名。6. 在Cytometer指令欄中，選擇Counters,將此對(duì)話框移至合適位置，以便于隨時(shí)觀察events計(jì)?數(shù)。7. 將樣品試管放至檢測(cè)區(qū)，在AcquireControl對(duì)話框中選取Acquire以啟動(dòng)樣品分析測(cè)定。8. 微調(diào)儀器設(shè)定，待細(xì)胞群分布合適后選擇Acqu讓eControl對(duì)話框中Pause,Abort,去除Setup前的“3”，開(kāi)始正式獲取信號(hào)，存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。9. 當(dāng)一定數(shù)口的細(xì)胞被測(cè)定后，獲取會(huì)自動(dòng)停止，并會(huì)自動(dòng)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。重復(fù)步驟7,繼續(xù)分析下一個(gè)樣品，直到所有的樣品數(shù)據(jù)分析完畢。.當(dāng)所有樣品分析分析完畢，即換上三蒸水,并將流式細(xì)胞儀置于“STANDB”Y狀態(tài)，以保護(hù)激光管。五.關(guān)機(jī)程序：1. 從File中選擇Quit,退出軟件，選擇Don'tSave至蘋(píng)果屏幕。2. 用4ml1：10稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位(vacuumison),以外管吸去約2ml,在將樣品架置于中位(