辛伐他汀對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響

1、    辛伐他汀對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響            作者：姚樹生,張柳,鄭杰 時(shí)間：2007-11-22 11:30:00                     【關(guān)鍵詞】  辛伐他汀；,骨髓基質(zhì)細(xì)胞；,骨質(zhì)

2、疏松；,成骨細(xì)胞；,核心結(jié)合因子Effect  of  simvastatin   on   osteoblastic  differentiation  of  bone  marrow   stromal  cells  in  rats【Abstract】  AIM: To study the effect on osteoblastic differentiation and proliferation of bone marr

3、ow stromal cells in vitro by administration of simvastatin in vivo and to elucidate the mechanism of the anabolic osteogenetic  effect  of  simvastatin. METHODS:  Thirty 3monthold virgin female SD rats, weighting 250-300 g were randomly divided into 3 groups: Group 1, control, 10

4、 rats; Group 2, given simvastatin 10 mg/(kgd), 10 rats; Group 3, given simvastatin 20 mg/(kgd), 10 rats. All of the animals were given the agents through gastric tube for 28 d. At 29th day all the rats were sacrificed. Bone marrow stromal cells in femur and tibia were cultured in vitro. After treate

5、d with same condition for 14 d ALP activity of bone marrow stromal cells in supernatant was determined. The mRNA level of cbfa1 was detected by RTPCR, and cbfa1 protein expression was analyzed by Western blot. Cell count kit (CCK8) was used to examine the cell proliferation. RESULTS: After the rats

6、were administrated with differentdose simvastatin in vivo for 28 d, and then the bone marrow stromal cells were cultured for 14 d in vitro, the level of cbfa1 mRNA was increased, and the expression of cbfa1 protein also increased in a dosedependent manner, and supernatant ALP activity increased in a

7、 dosedependent manner. Ttest showed that the proliferation of bone marrow stromal cells in Group 2 had significant difference, but no significant difference in Group 3, when compared with control group. CONCLUSION: Simvastatin leads to the high expression of cbfa1 in bone marrow stromal cells and in

8、creased ALP activity, which may be parts of the mechanisms underlying the anabolic osteogenetic effect of simvastatin.【Keywords】 Simvastatin;   bone marrow stromal cell;   osteoporosis;   osteoblast;  cbfa1【摘要】  目的：研究辛伐他汀體內(nèi)給藥后對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中成骨分化和增殖的影響，探討其刺激成

9、骨的作用機(jī)制. 方法：30只SD雌性大鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只. G1組（C）為對照組；G2組（SIM10）給予辛伐他汀10 mg/(kgd)；G3組（SIM20）給予辛伐他汀20 mg/(kgd). 連續(xù)給藥28 d后，取大鼠的骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)14 d后用RTPCR和Western  blot分別檢測cbfa1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化；收集上清液，檢測細(xì)胞堿性磷酸酶；應(yīng)用cell counting kit(CCK8) 測定細(xì)胞增殖情況.  結(jié)果：辛伐他汀體內(nèi)干擾28 d后，再經(jīng)過骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)誘導(dǎo)14 d后，cbfa1因子的mRNA及蛋白表達(dá)水平均增高，呈劑

10、量依賴關(guān)系. 上清液堿性磷酸酶表達(dá)增高，呈劑量依賴關(guān)系. 實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，G2組（10 mg）組促進(jìn)細(xì)胞增殖，而G3組（20 mg組）未見顯著性差異.  結(jié)論： 辛伐他汀可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞中cbfa1 mRNA和蛋白的表達(dá)，堿性磷酸酶活性增高，辛伐他汀刺激成骨的作用機(jī)制可能與此有關(guān).【關(guān)鍵詞】 辛伐他?。?骨髓基質(zhì)細(xì)胞； 骨質(zhì)疏松； 成骨細(xì)胞； 核心結(jié)合因子0引言他汀類藥物是競爭性3羥基3甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶抑制劑，能夠降低肝內(nèi)膽固醇的生物合成. 是近20 a來發(fā)展起來的一類新型調(diào)脂藥，目前廣泛用于治療高膽固醇血癥. 1999年Mundy等1經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)篩選了3

11、0 000多種天然或人工化合物后發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可引起成骨細(xì)胞系的骨形成蛋白2（BMP2）的高表達(dá)，并能有效地刺激骨形成. 繼Mundy之后，同樣的發(fā)現(xiàn)，通過灌胃法口服給藥（辛伐他汀），正常及去勢大鼠2 皆可見小梁骨量增加. 并伴隨成骨作用有破骨細(xì)胞數(shù)量的減少. 在臨床的回顧性研究中也發(fā)現(xiàn)，服用他汀類藥物可以增加血清中骨鈣素（osteocalcin,OCN）的水平3. 并降低股骨頸骨折的發(fā)病率4-5. 但具體作用機(jī)制尚不清楚，辛伐他汀對骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用如何，目前國內(nèi)外少見報(bào)道. 本研究采用體內(nèi)給藥然后體外對骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)的方法，旨在觀察辛伐他汀對骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSc）成

12、骨分化的影響，以探討其促進(jìn)骨形成，治療骨質(zhì)疏松的機(jī)制.1材料和方法1.1材料1.2方法統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析. 不同給藥劑量的實(shí)驗(yàn)組與對照組進(jìn)行方差分析及Dunnettt檢驗(yàn)，P0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1倒置相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀測骨髓細(xì)胞接種后68 h，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMS）開始貼壁. 隨培養(yǎng)時(shí)間延長，未貼壁的懸浮細(xì)胞死亡或隨細(xì)胞液丟棄. 培養(yǎng)瓶中只有貼壁的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞呈典型梭形或多角形的成纖維細(xì)胞. 培養(yǎng)約56 d后，細(xì)胞融匯至0.8左右.2.2RTPCR骨髓基質(zhì)細(xì)胞在辛伐他汀給藥組中cbfa1的mR

13、NA水平較對照組升高，G3組（20 mg組）水平更高（P<0.01,表1，圖1）.表1不同組別cbfa1 mRNA的表達(dá)(略)2.3Western  blot結(jié)果顯示辛伐他汀給藥組G2 和G3組較對照組核蛋白cbfa1表達(dá)增高，而G3組（20 mg組）表達(dá)更高(P<0.01,表2，圖2).表2不同組別cbfa1蛋白的表達(dá)(略)2.4上清液ALP活性辛伐他汀給藥組ALP活性高于對照組. G3組（20 mg組）增加更顯著(P<0.01, 圖3）.2.5細(xì)胞增殖與對照組比較，辛伐他汀給藥組中，G2組（10 mg組）與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），可促進(jìn)骨髓

14、細(xì)胞增殖，而G3組（20 mg組）未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05, 圖4).3討論通過本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)辛伐他汀促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞相關(guān)因子ALP及cbfa1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化，10 mg組有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用.骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為一種多能干細(xì)胞，在特定條件下不僅可分化為成骨細(xì)胞，還可分化為脂肪細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，甚至神經(jīng)細(xì)胞等7. 而在骨組織工程學(xué)和骨質(zhì)疏松治療學(xué)方面，如何能有效的刺激BMSc定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值. ALP是成骨細(xì)胞的特異表型，ALP的活性在一定程度上反映成骨細(xì)胞分化程度和功能狀態(tài). 其活性越高，說明前成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞分化越

15、明顯. 宋純理等8-9發(fā)現(xiàn)在辛伐他汀對骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)干擾過程中，ALP活性明顯增高，BMP2高表達(dá)并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系OCN，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達(dá)水平增高，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系. 本研究結(jié)果與其一致，提示辛伐他汀有促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向更多成骨細(xì)胞分化的潛質(zhì)，并且可能具有刺激分化成熟的成骨細(xì)胞的成骨功能.新近研究表明，核結(jié)合因子a1 即cbfa1轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵因子，屬于Runt結(jié)構(gòu)域家族，因此又稱Runx2（Runt  related  gene  2）. Cbfa1是成骨細(xì)胞分化早期的標(biāo)志物，它可調(diào)節(jié)OCN基因表達(dá). Du

16、cy等10在小鼠和大鼠骨鈣素基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了與cbfa1的Runt結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的連接基序，即成骨細(xì)胞特異性作用元件2（OSE2）. 隨后又發(fā)現(xiàn)在型膠原（COI1）， OPN,骨結(jié)蛋白（ON）等成骨細(xì)胞標(biāo)志基因中也存在這種啟動(dòng)子元件，cbfa1通過調(diào)節(jié)這些基因在成骨細(xì)胞的表達(dá)，來促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟. 當(dāng)非成骨細(xì)胞異位表達(dá)cbfa1時(shí)，可使這些細(xì)胞表達(dá)骨鈣素，而缺乏cbfa1基因的小鼠骨組織僅有軟骨細(xì)胞和軟骨，而無骨形成11. 人類常染色體顯性遺傳病鎖骨顱骨發(fā)育不良綜合癥就是由cbfa1一個(gè)等位基因突變引起12. OPG（osteoprotegerin）是由成骨細(xì)胞分泌的破骨細(xì)胞分化和

17、功能的抑制因子，其在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)也同cbfa1密切相關(guān)13. 本實(shí)驗(yàn)中可見到辛伐他汀促進(jìn)了cbfa1因子mRNA和蛋白的表達(dá)，說明辛伐他汀可通過提高cbfa1因子的表達(dá)來促進(jìn)BMS分化為成骨細(xì)胞，從而使成骨細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng).Cbfa1表達(dá)也受許多生長因子，激素以及轉(zhuǎn)錄因子的影響，Viereck等14報(bào)道cbfa1為成骨細(xì)胞分化成熟過程中BMP2, TGF和地塞米松的靶基因. 其中BMP是促進(jìn)成骨細(xì)胞分化有效的細(xì)胞外因子，這類因子可通過Smads信號途徑誘導(dǎo)cbfa1表達(dá)，并可能通過調(diào)節(jié)cbfa1Osx和其他轉(zhuǎn)錄因子來影響成骨細(xì)胞分化15. 他汀類藥物進(jìn)入體內(nèi)后以前體藥物的形式對蛋白酶體有抑

18、制作用，進(jìn)而抑制了BMP的下游信號調(diào)節(jié)蛋白Smad的降解，使BMP的含量增加. 但其明確，具體的作用靶點(diǎn)和途徑機(jī)制有待進(jìn)一步研究和證實(shí).目前已知與增殖激活有關(guān)的基因有cmyc, cfos, cjun, 與細(xì)胞周期有關(guān)的基因有組蛋白，細(xì)胞周期素基因. H4組蛋白的基因表達(dá)伴隨細(xì)胞內(nèi)DNA的合成，與增殖密切相關(guān). 本實(shí)驗(yàn)中10 mg組促進(jìn)細(xì)胞增殖，而20 mg組與對照組比較未見顯著性差異. 辛伐他汀對增殖作用的機(jī)制是與激活相關(guān)基因有關(guān)還是與細(xì)胞周期基因有關(guān)，是否存在雙向作用機(jī)制，即在較低劑量時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，而在較高劑量時(shí)抑制成骨細(xì)胞增殖尚待進(jìn)一步研究證實(shí).目前，辛伐他汀已成為治療骨質(zhì)疏松的新型

19、藥物，對其成骨作用做了大量研究，但其臨床應(yīng)用尚待進(jìn)一步證實(shí)，同樣也有報(bào)道16，辛伐他汀可促進(jìn)小鼠骨折愈合. 對骨折愈合的相關(guān)因子表達(dá)和具體作用機(jī)制未見其他報(bào)道. 因此，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討辛伐他汀對成骨作用的機(jī)制，為他汀類藥物用于臨床骨質(zhì)疏松和骨折愈合治療提供依據(jù)，將更有意義.【參考文獻(xiàn)】1Mundy G, Garret R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins J. Science, 1999,286:1946-1949.2Maria P, Waldemar J, M

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21、 human mesenchymal stem cellsJ. Science, 1999, 284:143-147.8宋純理,黨耕町,郭昭慶,等. 辛伐他汀對骨髓基質(zhì)細(xì)胞骨形成蛋白2表達(dá)及對堿性磷酸酶的活性的影響J.中國修復(fù)重建外科, 2002, 16（6）：384-387.9宋純理, 黨耕町, 等.  辛伐他汀促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化 J. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2003, 35: 533-536.10Ducy P, Zhang R, Geoffroy A, et al. Osf2/Cbfa1:A transcriptional activator of osteoblast

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