革蘭氏染色法.總結(jié)VIP

1、革蘭氏染色法(Gram'sstain) 是最常用的細(xì)菌染色法，本實(shí)驗(yàn)要求同學(xué)能正確掌握此染色方法的操作技術(shù)，理解其在鑒別細(xì)菌上的重要意義。【原理】細(xì)菌經(jīng)結(jié)晶紫初染染成藍(lán)色。革蘭氏染色陽(yáng)性菌 （ G+ ）細(xì)胞壁肽聚糖層數(shù)多，且肽聚糖為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再經(jīng)乙醇脫水，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為致密，染料復(fù)合物不易從細(xì)胞內(nèi)漏出，仍為藍(lán)色。而革蘭氏染色陰性菌（G- ）細(xì)胞壁脂類含量多，肽聚糖層數(shù)少，且肽聚糖為平面片層結(jié)構(gòu)，易被乙醇溶解，使細(xì)胞壁通透性增高，結(jié)合的染料復(fù)合物容易泄漏，細(xì)菌被脫色為無(wú)色，再經(jīng)石炭酸復(fù)紅稀釋液復(fù)染成紅色。【材料】【方法】按涂片干燥固定染色鏡檢的順序進(jìn)行。準(zhǔn)備載物玻片：用鑷子從載物片缸中

2、取出經(jīng)3 鹽酸酒精脫脂的載物玻片，用擦片布擦凈，然后用特種鉛筆在玻片背面畫一個(gè)直徑為1.52.0cm的圓圈，做為涂膜的標(biāo)記范圍。1 涂片：按無(wú)菌操作取材法進(jìn)行，具體步驟如下：用肉湯培養(yǎng)物涂片： 右手拿接種環(huán)的黑色塑料柄部分，左手托持試管。 將接種環(huán)按15°角放在煤氣燈的外焰中燒灼滅菌，直到把金屬絲燒紅 ( 圖 1-2) ，然后將鋁制的銀色柄部也通過(guò)火焰略加燒灼。 用右手小指和手掌的前內(nèi)緣拔掉左手所持試管的棉塞，并立即將試管口用火焰燒灼滅菌。 用滅菌后已冷卻的接種環(huán)伸入試管中取出材料( 圖 1-3) ，此時(shí)注意勿使沾有材料的接種環(huán)觸碰試管壁及試管口。 將試管口再次滅菌，棉塞也要在火焰上

3、略加燒灼（時(shí)間要短以免點(diǎn)燃棉塞），塞好棉塞，放回原處。 將接種環(huán)上之材料涂于載物片上，隨后立即將接種環(huán)用火焰燒灼滅菌。為防止細(xì)菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留的細(xì)菌。用斜面培養(yǎng)物涂片：用細(xì)菌斜面培養(yǎng)物涂片，需預(yù)先取一接種環(huán)生理鹽水放在載物片上，然后再按無(wú)菌操作取材法從斜面培養(yǎng)物上取少量菌苔，在水滴內(nèi)輕輕研磨將細(xì)菌制成菌懸液，再涂成一薄膜。無(wú)菌操作取材步驟同前。2 干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦。3 固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通過(guò)三次，以固定之。此時(shí)殺死

4、大部分細(xì)菌，并使標(biāo)本固定于玻片上，以免在染色或水洗過(guò)程中被沖掉。4 染色：將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min 。水洗后加蘆戈氏碘液處理( 媒染 )1min。水洗后用95 酒精脫色，脫色時(shí)頻頻搖動(dòng)玻片，直至流下的液體無(wú)色為止 ( 約需 0.5min)。水洗后加石炭酸復(fù)紅稀釋液染色( 復(fù)染 )0.5min。水洗，用濾紙輕輕吸干，待標(biāo)本充分干燥后進(jìn)行鏡檢。染色過(guò)程中，水洗要用自來(lái)水的細(xì)流徐徐沖洗，沖洗涂膜的背面，勿使強(qiáng)水流直接沖到涂膜上?！窘Y(jié)果觀察】使用油鏡觀察，注意標(biāo)本中兩種細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪種細(xì)菌是革蘭氏陽(yáng)性菌( 染成紫色 ) ，哪種細(xì)菌是革蘭氏陰性菌(

5、染成紅色 ) 。將在標(biāo)本中觀察到的細(xì)菌形態(tài)和染色性，用有色鉛筆畫出模式圖，并附以文字說(shuō)明。注意事項(xiàng)：酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過(guò)度，則革蘭氏陽(yáng)性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽(yáng)性菌，所以脫色時(shí)間要很好掌握。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄的影響，一般涂片時(shí)取菌要少，涂片薄而均勻?yàn)楹?。被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會(huì)影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽(yáng)性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在1824h之內(nèi)。1 革蘭氏染色液的制備結(jié)晶紫染液用天秤量取結(jié)晶紫5g 放乳缽內(nèi)研碎，一面研磨一面徐徐加入95 酒精使之溶解。加

6、入酒精全量為100m1，制成酒精飽和液( 原液 ) 。取原液 20ml ，與1 草酸銨水溶液80ml混合，用濾紙過(guò)濾。供革蘭氏染色初染用。蘆戈氏碘液碘 1g碘化鉀 2g蒸餾水 300ml配法是先用數(shù)毫升蒸餾水溶解碘化鉀，然后加碘使其全溶解，最后加蒸餾水至300ml。供革蘭氏染色媒染用。稀釋石碳酸復(fù)紅染液取堿性復(fù)紅10g 和 95 酒精 100ml，按上述方法同制成復(fù)紅酒精飽合液。取復(fù)紅飽和液10ml ，與 5 石碳酸水溶液90ml混合，用濾紙 . 過(guò)濾，再用蒸餾水稀釋10 倍。供革蘭氏染色復(fù)染用。細(xì)菌的特殊染色技術(shù) 芽孢染色莢膜染色鞭毛染色一目的要求：學(xué)習(xí)掌握芽孢、莢膜和鞭毛染色原理和方法。二

7、原理：芽孢染色法是根據(jù)細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親和力不同的原理，用不同的染料進(jìn)行染色， 使芽孢和菌體呈不同顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，當(dāng)用弱堿性染料孔雀綠在加熱的情況下進(jìn)行染色時(shí)， 此染料可以進(jìn)入菌體及芽孢使其著色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出。若再?gòu)?fù)染（蕃紅液），則菌體呈紅色而芽孢呈綠色。觀察莢膜通常采用負(fù)染色法，即將菌體染色后，再使背景著色，從而把莢膜襯托出來(lái)。觀察鞭毛是采用在染色的同時(shí)將染料堆積在鞭毛上使它加粗的方法。細(xì)菌只有在個(gè)體發(fā)育到一定的時(shí)期才具有鞭毛， 一般在多次移種之后，在其旺盛生長(zhǎng)階段染色。三實(shí)驗(yàn)材料：1 菌種：巨大芽孢桿菌 (B.megaterium

8、) ：營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng) 20hs 產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes) ：肉汁等斜面培養(yǎng)20hs普通變形桿菌 (Proteus vulgaris)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)18hs2 染料：（ 1 ）芽孢染色用 7.6% 飽和孔雀綠液、 0.5% 蕃紅液（或石炭酸復(fù)紅液和呂氏美藍(lán)液）（ 2 ） 莢膜染色用剛果紅、明膠水溶液，呂氏美藍(lán)液等。（ 3 ） 鞭毛染色用硝酸銀染色液 （A、B 液）; 或 Leifson 染色液（A、B、C 液）3 其它：顯微鏡、載波片、接種環(huán)、酒精燈、香柏油、二甲苯、無(wú)菌水、1% 鹽酸、電爐、墨汁、 20%CuSO4 、95% 乙醇、擦鏡紙等。四實(shí)驗(yàn)方法

9、與步驟：（一）芽孢染色：介紹兩種常用的方法1. 孔雀綠染色法：取一干凈載片按無(wú)菌法取巨大芽孢桿菌菌體少許制成涂片，風(fēng)干固定后，在涂菌處滴加法 7.6% 的孔雀綠飽和水溶液， 染色 10 分鐘后，用水沖洗，再用 0.5% 蕃紅花紅液染色彩 1 分鐘，水洗，風(fēng)干后鏡檢。芽孢被染成綠色，營(yíng)養(yǎng)體呈紅色。2. 石炭酸復(fù)紅染色法：在一支小試管（ 10*100mm ）中，滴入 3 4 滴蒸溜水，用接種環(huán)取巨大芽孢桿菌于水中，充分?jǐn)噭?，使菌體分散，制成較濃的菌懸液。然后滴加等體積的 (3 4 滴 ) 石炭酸復(fù)紅掖搖勻。將此試管放入沸水浴中煮10 15 分鐘，使芽孢及菌體著色。取此菌液體 2 3 環(huán)在潔凈的載片

10、上做成涂片，自然干燥通過(guò)火焰固定后，在自來(lái)水下緩緩沖洗，使菌體脫色，再用呂氏美藍(lán)液復(fù)染 1 2 分鐘。用水洗去多余染液，輕輕用吸水紙吸去水分，干后鏡檢，結(jié)果可見(jiàn)芽孢被染成紅色，菌體呈現(xiàn)藍(lán)色。（二）莢膜染色法1. 方法將剛果紅水溶液和明膠水溶液各一滴滴于干凈載片上； 用接種環(huán)蘸取細(xì)菌培養(yǎng)液或懸浮液在載片上于上述兩滴溶液混勻，自然干燥；滴加 1%HCl 沖洗，使涂片呈藍(lán)色；用蒸餾水漂洗，除去 HCl ；，用美藍(lán)復(fù)染 1 分鐘，水洗，自然干燥后鏡檢。鏡檢：有莢膜的菌，菌體藍(lán)色，莢膜不著色，背景藍(lán)紫色；無(wú)莢膜的菌，菌體藍(lán)色，背景藍(lán)紫色。由于干燥菌體收縮， 菌體四周也可能有一圈狹窄的不著色環(huán)，但這不是莢

11、膜。莢膜不著色的部分寬。2. 方法 濕墨汁法（ 1）制菌液：加一滴墨汁于潔凈的波片上，并挑少量菌與其充分混合。（ 2）加蓋玻片：放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下 輕壓，吸收多余菌液。（ 3） 鏡檢。結(jié)果：背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。3.方法 TyLer 法（ 1） 涂片：按常規(guī)法涂片，在空氣中自然干燥。（ 2） 染色：用結(jié)晶紫冰醋酸染 5 7 分鐘。（ 3） 用 20%CuSO4 水溶液洗，再用毛邊紙吸干。（ 4） 鏡檢并觀察結(jié)果：莢膜藍(lán)紫色，細(xì)胞暗藍(lán)色。（三鞭毛染色法1. 銀鹽染色法（ 1）清洗玻片 : 選擇光滑無(wú)裂痕的玻片 ,最好選用新的。

12、為了避免玻片向后重疊，應(yīng)將玻片插在專用金屬架上。然后將玻片置洗衣粉濾過(guò)液中（洗衣粉先經(jīng)煮沸，再用濾紙過(guò)濾，以除去粗顆粒） ，煮沸 20 分。取出稍冷后即用自來(lái)水沖洗，晾干。再放入濃洗液中浸泡 5 6 天。使用前取出玻片，用水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入 95% 乙醇中脫水。取出玻片，在火焰上燒去酒精，立即使用。（ 2）菌液的制備及涂片：用于染色的菌種應(yīng)預(yù)先連續(xù)移接 5 至 7 代。染色前用于 接菌的培養(yǎng)基應(yīng)是新鮮制備的， 表面較濕潤(rùn)，在斜面底部應(yīng)有少許冷凝水。 將變形桿菌接種于肉湯斜面上， 在適宜的溫度下培養(yǎng) 15 至 18 小時(shí)后，用接 種環(huán)挑取斜面底部菌苔數(shù)環(huán)，輕輕地移入盛有

13、1 毫升與菌種同溫的無(wú)菌水 中，不要振動(dòng)，讓有活動(dòng)能力的菌游入水中，呈輕度混濁。在最適溫度下保溫 10 分鐘，讓老菌體下沉，而幼齡菌體在無(wú)菌水中可松開(kāi)鞭毛。然后從試管上端挑數(shù)環(huán)菌液，置于潔凈玻片的一端，稍稍傾斜玻片，使菌液緩慢地流向另一端。置空氣中自然干燥。（3） 染色： 滴加A液，染4至6分鐘。 用蒸餾水輕輕地充分洗凈A 液。 用 B 液沖去殘水，再加B 液于玻片上，在微火上加熱至冒蒸汽，約維持 0.5 至 1 分鐘（加熱時(shí)應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染料，不可使玻片出現(xiàn)干涸部分）。 用蒸餾水洗，干燥。 鏡檢結(jié)果：菌體和鞭毛呈深褐色至黑色。2. Leifson染色法（ 1） 清洗玻片法同 1。（ 2）

14、 菌液的制備及涂片 菌液的制備同 1 用削尖臘筆在潔凈玻片上劃分3 至 4 個(gè)相等的區(qū)域。 放一小環(huán)菌液于每一區(qū)的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一端。在另一端用一張吸水紙吸去多余的菌液。 涂片在空氣中自然干燥。（3）染色 加染色液于第一區(qū)，使染料覆蓋涂片。隔數(shù)分鐘后染料加入第二區(qū)，以后依此類推（相隔時(shí)間可自行決定） ，其目地是由于染色時(shí)間長(zhǎng)短受菌種、 室內(nèi)溫度、濕度等因素的影響。這樣便于確定最合適的染色時(shí)間，且節(jié)省材料。在染色過(guò)程中要仔細(xì)觀察。 當(dāng)整個(gè)玻片出現(xiàn)鐵銹色沉淀和染料表面出現(xiàn)金色膜時(shí) , 就可用水輕輕地沖洗 , 一般約 10 至 15 分鐘 . 水洗 : 在沒(méi)有傾去染料的情況下就用自來(lái)

15、水輕輕洗去染料 , 否則會(huì)增加背景的沉淀。 自然干燥。 鏡檢。結(jié)果：細(xì)菌和鞭毛都染成紅色。八染色液附錄：1 硝酸銀染色液A 液：丹寧酸5 克FeCl31.5 克蒸餾水100毫升待溶解后，加入1% NaOH溶液 1 毫升和 15% 甲醛溶液 2 毫升。B 液：硝酸銀2 克蒸餾水100 毫升待硝酸銀溶解后，取出10 毫升做回滴用。往90 毫升 B 液中滴加濃NH4OH 溶液，當(dāng)出現(xiàn)大量的沉淀時(shí)再繼續(xù)加氫氧化氨，直到溶液中沉淀剛剛消失變澄清為止。 然后用保留的 10 毫升 B 液小心地逐滴加入， 至出現(xiàn)輕微和穩(wěn)定的薄霧為止（此操作非常關(guān)鍵，應(yīng)格外小心）。在整個(gè)滴加過(guò)程中要邊滴邊充分搖蕩。配好的染色液當(dāng)日有效。4 小時(shí)內(nèi)效果最好。2 Leifson 染色液A 液：堿性復(fù)紅1.2 克95% 乙醇100 毫升B 液：丹寧酸3 克蒸餾水100毫升如加 0.2%苯酚，可長(zhǎng)期保存。C 液： NaCl1.5 克蒸餾水100毫升染色液貯與磨口瓶中。在室溫下較穩(wěn)定。使用前將上述溶液的等體積混合。此混合液貯于密封性良好的瓶中置于冰箱可保存數(shù)星期。在較高溫度下會(huì)因混合液發(fā)生化學(xué)變化而使著色力日益減弱。書是我們時(shí)代的生命 別林斯基書籍是巨大的力量 列寧書是人類進(jìn)步的階梯 高爾基書籍是人類知