溶菌酶檢驗標準

1、1 術語和定義溶菌酶酶活性單位：在25C、pH值為6.2的條件下，于450nm處每分鐘引起溶酶小球菌體（MicrococcusLysodeiktidus）溶液吸光度下降0.001所需要的酶量為一個酶活性單位U。本定義適合“比濁法”。溶菌酶效價：溶菌酶在一定濃度范圍內，其對數(shù)計量與抑菌圈直徑（面積）呈對數(shù)關系，通過檢測其對微生物的抑制作用，比較標準品與樣品產生抑菌圈的大小，計算出樣品的效價，單位為uo本定義適合“管碟法”。2 技術要求2.1 外觀和性狀要求粉酶為白色或微黃色的結晶或無定形粉末。2.2 技術指標4.2.1 粉酶水分含量：12%。4.2.2 粉酶粒度：420血徑分析篩篩上物W4%4.

2、2.3 粉酶熾灼殘渣：10.0%。4.2.4 酶活（效價）指標表1產品成分分析保證值項目指標粉X犬50型溶菌酶酶活性（效價），）U/g（u）5000004.2.5 衛(wèi)生指標符合GB13078和NY/T722的有關規(guī)定。3試驗方法本標準所用試劑和水，在沒有注明其他要求時，均指分析純試劑和GB/T6682中規(guī)定的三級水，所用試液中的標準溶液，在沒有注明其他要求時均要求按GB/T601,GB/T602制備。3.1 外觀的測定取樣品少許放入燒杯，下襯白紙進行目測。3.2 粉酶水分的測定按GB/T6435規(guī)定進行檢測。3.3 粉酶粒度的測定按GB/T5917規(guī)定進行檢測。3.4 粉酶熾灼殘渣的測定按中國

3、獸藥典規(guī)定進行檢測。3.5 衛(wèi)生指標的測定按飼料衛(wèi)生標準GB13078和NY/T722規(guī)定的方法進行。3.6 溶菌酶酶活性(效價)的測定溶菌酶微生物測定法系在適宜條件下，通過檢測溶菌酶對微生物的抑制作用，計算出溶菌酶活性(效價)的方法。依據(jù)試驗設計原理不同，可分為比濁法和瓊脂擴散法(即管碟法)。3.6.1 試劑和溶液5.6.1.1 溶酶小球菌(MicrococcusLysodeiktidus)將溶酶小球菌接種于固體培養(yǎng)基上，置37培養(yǎng)48小時，用無菌水將菌體洗下，用紗布濾過，濾液離心后，傾去上層清液，用水洗滌菌體數(shù)次，然后用少量水懸浮，冰凍干燥，得淡黃色粉末，供測定用，保存一年。使用時，在營養(yǎng)

4、瓊脂斜面上活化，傳代培養(yǎng)，工作用菌種不超過5代，斜面菌種從培養(yǎng)好到使用時間，最長不超過2個月。并將培養(yǎng)好的斜面菌種，放置4冰箱保存。制備的菌懸液可以使用一周，不用時放置4冰箱保存。5.6.1.2 磷酸緩沖液稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)11.7g,磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)7.86g，加900mL水溶解,調pH值至6.2，定容至1000mL。5.6.1.3 10氫氧化鈉溶液5.6.1.4 1硫酸銅溶液5.6.1.5 30%三氯醋酸5.6.1.6 斜面培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂5.6.1.7 抗生素檢定培養(yǎng)基II號5.6.1.8 溶菌酶標準品5.6.1.9 儀器5.6.2.1 分

5、析天平：精密度0.1mg；5.6.2.2 牛津杯：牛津杯內徑6.0±0.1mm,外徑7.8±0.1mm,高10.0±0.1mm,每套牛津杯的重量差異不超過±0.05g，內外壁及兩端面光滑平坦。管壁厚薄一致；5.6.2.3 陶瓦蓋：內徑約103mm外徑108mm平坦，吸水性強。應定期清洗、干燥或干熱滅菌；5.6.2.4 游標卡尺：精度0.02mm；5.6.2.5 雙碟：內徑約90mm外徑16mmr17mmi勺硬質玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，碟底厚薄均勻，水平透明，無色斑氣泡；5.6.2.6 超凈工作臺：有效工作面局部潔凈度100級。用于試驗菌的接種傳代或菌懸液制備

6、；5.6.2.7 pH酸度計：精確到0.01;5.6.2.8 分光光度計：配10mm比色皿，可在450nm下測定吸光值；5.6.2.9 離心機：轉速為4000r/min以上；5.6.2.10 秒表：每小時誤差不超過5s；5.6.2.11 恒溫培養(yǎng)箱：設置漂移溫度為35c37C;5.6.2.12 高壓滅菌鍋5.6.2.13 烘箱5.6.2.14 其它玻璃器皿：刻度吸管：1mL,2mL5mL10mL,25mL無菌吸管等；3.6.3試驗方法5.6.3.1 鑒另1J固體樣品：取本品10mg,溶于1mL水中，加30%三氯醋酸2滴，產生白色沉淀。取試管一支，加5%溶菌酶水溶液2滴、10%氫氧化鈉5滴及1%

7、硫酸銅溶液1滴，混勻后，應顯紫玫瑰色。5.6.3.2 方法一：比濁法特定濃度的溶酶小球菌懸浮液在450nm條件下存在一定吸光度，溶酶菌作用于溶酶小球菌底物會引起吸光度降低，通過計算指定時間內吸光度降低的幅度可以計算出溶菌酶的活力。試驗步驟：精確稱取樣品（液體樣品需在離心機上以3500r/min離心10min后取上清液）不少于20mg,用pH6.2的0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋到酶活單位為100U/mL200U/mL,備用。將保存好的溶酶小球菌在營養(yǎng)瓊脂斜面上活化，傳代兩次后的菌體37c培養(yǎng)48小時，再用生理鹽水從培養(yǎng)基上洗脫下來，并稀釋到一定倍數(shù)，使其在25c時，在450nm波長處測定的吸光

8、度A。為0.650.75之間。精密取底物懸浮液2.5mL,放入比色杯中，在450nm波長處測定其吸光度，作為零時讀數(shù)，然后取1¥品溶液0.5mL,加入比色杯中，用秒表開始計時，迅速混合，以磷酸緩沖液做空白，到60秒時記下吸光度A60、。試樣酶活力的計算：1000Xd=X（A0-A60）XNX2（1）M式（1）中：Xd待測樣品的溶菌酶活力，U/g（或mL）Ao0秒時的吸光度A6060秒時的吸光度M一樣品質量，g（或mL）LN一樣品總的稀釋倍數(shù)5.6.3.3 方法二：管碟法利用溶菌酶的抗菌性質及其溶液在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，將未知效價的樣品液與已知效價的標準溶液，在同一條件下，在攤布高

9、度敏感性特定試驗菌的培養(yǎng)基上進行一定時間的對照培養(yǎng)，溶菌酶溶液在培養(yǎng)基內的擴散到達適當范圍內時就產生了抑制試驗菌生長的透明抑菌圈，并且在一定的溶菌酶濃度范圍內，溶菌酶對數(shù)濃度與抑菌圈直徑成正比。經比較標準液與樣品兩者抑菌圈直徑或面積大小，采用二劑量法，即可推算出樣品的效價。菌懸液的制備：將保存好的溶酶小球菌在營養(yǎng)瓊脂斜面上活化，傳代兩次后的菌體37c培養(yǎng)48小時，再用10mL生理鹽水將一支培養(yǎng)好的溶酶小球菌斜面菌體洗下制成菌懸液，盡量保證每次所加指示菌的濃度一樣，供測定用。測定平板的制備：底層：用滅菌破口移液管（25mL）,吸取已融化的培養(yǎng)基20mL注入雙碟內，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋。菌層：

10、取出溶酶小球菌菌懸液，按1%的菌量添加，吸取菌懸液加入已融化冷卻至50C55c的培養(yǎng)基內，搖勻作為菌層用。用滅菌10mL破口移液管，吸取菌層培養(yǎng)基5mL,使均勻分布在底層培養(yǎng)基上，置水平臺上，用陶瓦蓋覆蓋，放置40min,待凝固，備用。待測酶液的準備：精確稱取樣品（液體樣品需在離心機上以3500r/min離心10min后取上清液）不少于20mg,用pH6.2的0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋到酶活單位在5000U/mL左右，備用。標準品、樣品的滴加：取8個雙碟，在每個雙碟中對稱放入4個牛津杯，分別成對角滴加標準品高（SH）、標準品低（SL）及樣品高（TH）、樣品低（TL）兩種濃度的溶液，直至牛津

11、杯口平滿。注意滴加溶液間隔不可過長，因溶液的擴散時間對測定結果有影響。（注意：標準品必須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能隔夜。從測定平板的制備到進入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，整個過程必須在2小時內完成）。雙碟的培養(yǎng)及抑菌圈的測量將雙碟置于37±0.5C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16小時18小時后，取出雙碟，測定抑菌圈直徑（如有破圈或不完整的抑菌圈，則應舍棄該碟）。樣品的高低劑量透明圈直徑盡量和標準品的高低劑量透明圈直徑接近，整個系統(tǒng)的透明圈直徑控制在15mm19mm之間。結果判定：微生物測定結果的正確性和精密度受很多因素影響，為了使測定結果更能真實的反映客觀情況，符合設計原理，就必須將測定結果按生物檢定統(tǒng)計，進行可靠性測驗及效價計算和可信限計算。統(tǒng)計學分析按藥典附錄的生物檢定統(tǒng)計法進行F的顯著性測驗，要求直線回歸和劑間要非常顯著（P<0.01）,偏離平行不應顯著（P>0.05）;且可信限率不得超過5%。實驗結果在可靠性成立前提下，方可根據(jù)設計的計算公式進行樣品效價計算。將樣品的估計效價控制在實際效價的90%110%,否則，需要重新估計效價進行測定。R =log 1T2 Ti -S2 -Si2_1 2- I 100%T2 S -Ti -Si(2)Pt=RxAt（3）式中：R: