-水中總大腸菌群的測(cè)定—多管發(fā)酵法[1]

1、 水中總大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法 一原理總大腸菌群可用多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法檢驗(yàn)。多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過三個(gè)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果以最可能數(shù)（most probable number），簡(jiǎn)稱MPN表示。三儀器(1)高壓蒸氣滅菌器。(2)恒溫培養(yǎng)箱、冰箱。(3)生物顯微鏡、載玻片。(4)酒精燈、3mm接種環(huán)。(5)培養(yǎng)皿（直徑100mm）、試管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、燒杯（200、500、2000mL）、錐形瓶（500、1000mL）、采樣瓶、移液槍。四培養(yǎng)基

2、及染色劑的制備1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：將10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH為7.27.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于試管中，于121高壓滅菌器中滅菌15min，貯存于冷暗處備用。2三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制備方法配制。除蒸餾水外，各組份用量增加至三倍。3伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：貯備培養(yǎng)基的制備：于2000mL燒杯中，先將20g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解。再加2.0g鄰酸二氫鉀及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸餾水補(bǔ)充至1000mL，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.27.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再

3、加入10g乳糖，混勻后定量分裝于250mL或500mL錐形瓶?jī)?nèi)，于121高壓滅菌15min，貯于冷暗處備用。平皿培養(yǎng)基的制備：將上述制備的貯備培養(yǎng)基融化。根據(jù)錐形瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的2%伊紅水溶液（0.4g伊紅溶于20mL水中）和一定量已滅菌的0.5%美藍(lán)水溶液（0.065g美藍(lán)溶于13mL水中），加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡），立即將此培養(yǎng)基適量?jī)A入已滅菌的空平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用。4革蘭氏染色劑：結(jié)晶紫染色液：將20mL結(jié)晶紫乙醇飽和溶液（稱取48g結(jié)晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL 1%草酸銨溶液混合、過濾

4、。該溶液放置過久會(huì)產(chǎn)生沉淀，不能再用。助染劑：將1g碘與2g碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分振蕩，待完全溶解后，用蒸餾水補(bǔ)充至300mL。此溶液兩周內(nèi)有效。當(dāng)溶液由棕黃色變?yōu)榈S色時(shí)應(yīng)棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。脫色劑：95%乙醇。復(fù)染劑：將0.25g沙黃加到10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加90mL蒸餾水。五測(cè)定步驟水源水于各裝有5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），分別加入10mL水樣；于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1mL水樣；再于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管

5、）分別加入1mL 110稀釋的水樣。共計(jì)15管，三個(gè)稀釋度。將各管充分混勻，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。平板分離：上述各發(fā)酵管經(jīng)培養(yǎng)24h后，將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，挑選符合下列特征的菌落：a伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。取上述特征的群落進(jìn)行革蘭氏染色：a用以培養(yǎng)1824h的培養(yǎng)物涂片，涂層要??；b將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液，1min后用水洗去；c滴加助色劑，1min后用水洗去；d滴加脫色劑，搖動(dòng)玻片，直止無紫色脫落為止（約203

6、0s），用水洗去；e滴加復(fù)染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈紅色者為陰性菌。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最典型菌落13個(gè)，然后置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者（不論倒管內(nèi)氣體多少皆作為產(chǎn)氣論），即證實(shí)有大腸菌群存在。根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽(yáng)性管（瓶）數(shù)查附表1“大腸菌群檢數(shù)表”，報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。結(jié)果與分析：初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)10ml原水+5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：5管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象1ml原水+10ml

7、普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：2管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，1管有產(chǎn)酸現(xiàn)象1ml1：10稀釋水樣+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：1管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：10ml原水+5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：5管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象1ml原水+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：2管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象1ml1：10稀釋水樣+10ml普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：1管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象結(jié)論：從最可能數(shù)（MPN）表中查檢驗(yàn)結(jié)果521，得知100mL水樣中的總大腸菌群數(shù)為70個(gè)，故1L水樣中的總大腸菌群數(shù)為70×10=700個(gè)。對(duì)污染嚴(yán)重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗(yàn)的接種水樣應(yīng)做110、1100、11000或更高倍數(shù)的稀釋，

8、檢驗(yàn)步驟同“水源水”檢驗(yàn)方法。如果接種的水樣量不是10mL、1mL和0.1mL，而是較低或較高的三個(gè)濃度的水樣量，也可查表求得MPN指數(shù)，再經(jīng)下面公式換算成每100mL的MPN值：附表1 大腸菌群檢數(shù)表接種水樣總量300mL（100mL2份，10mL10份）10mL水量的陽(yáng)性管數(shù)100mL水量的陽(yáng)性瓶數(shù)0121L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)012345678910<33711141822273136404813182430364351606911182738527092120161230>230附表2 最可能數(shù)（MPN）表（接種5份10mL水樣、5份1m

9、L水樣、5份0.1mL水樣時(shí)，不同陽(yáng)性及陰性情況下100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)和95%可信限值）出現(xiàn)陽(yáng)性份數(shù)每100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)95%可信限值出現(xiàn)陽(yáng)性份數(shù)每100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)95%可信限值10mL管1 mL管0.1 mL管下限上限10mL管1 mL管0.1 mL管下限上限000011111233444444444455555500120011202300111223340001110100010100100101201010012012<2224244665171713171721262226273334233443334663<0.5<0.5<0.5<0.5<0.5<0.5<0.5<0.5<0.55535579799111271115111621771171115151513464631464663786778809393708911093120150222223333355555555555555555501123001122223333444445555551010001010012012301234012345779912811111414497094791101401801301702202803502