(農(nóng)業(yè)大學(xué))生物化學(xué)(6)

1、1第三章、核酸（nucleic acid）2本章內(nèi)容提要：n第一節(jié)、核酸的發(fā)現(xiàn)與研究簡(jiǎn)史n第二節(jié)、核酸的種類、分布及功能n第三節(jié)、核酸的組成、結(jié)構(gòu)n第四節(jié)、核酸的理化性質(zhì)n第五節(jié)、核酸的研究方法3第一節(jié)、核酸的發(fā)現(xiàn)與研究簡(jiǎn)史n1868年，瑞士的外科醫(yī)生Friedrich Miescher從膿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了DNA。n1944 年， O. Avery 通過(guò)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明DNA是遺傳物質(zhì)n1953年， Watson-Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，為分子生物學(xué)的發(fā)展史奠定了基礎(chǔ)。n2000年，人類基因組計(jì)劃（HGP）基本完成：返回4肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)研究對(duì)象：肺炎雙球菌SIII型菌株：有莢

2、膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：無(wú)莢膜，菌落表面粗糙，無(wú)致病性56Watson-Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型7人類基因組計(jì)劃（HGP）：n1986年，著名生物學(xué)家H.Dulbecco在Science雜志率先提出；完成人類基因組DNA全序列測(cè)定；是生物學(xué)有史以來(lái)最巨大和意義深遠(yuǎn)的一項(xiàng)科學(xué)工程；將有益于人類健康、醫(yī)療、制藥、人口、環(huán)境等方面，對(duì)生命科學(xué)也有極大貢獻(xiàn)。n人類細(xì)胞有23對(duì)染色體，單倍體基因組大約有3109堿基對(duì)8第二節(jié)、核酸的種類、分布及功能一、核酸的種類n脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid， RN

3、A）兩大類。9nDNA：含有D-2-脫氧核糖和胸腺嘧啶；通常為雙鏈結(jié)構(gòu)，使DNA分子穩(wěn)定；是主要的遺傳物質(zhì)，通過(guò)復(fù)制而將遺傳信息由親代傳給子代。nRNA：含有D-核糖和尿嘧啶；通常為單鏈結(jié)構(gòu)（某些病毒為雙鏈RNA）；與遺傳信息的表達(dá)有關(guān)。10、DNA的種類n1、線型雙鏈DNA：真核生物染色體DNA、某些病毒DNA 。n2、環(huán)狀雙鏈DNA：原核生物染色體DNA、質(zhì)粒DNA、真核生物細(xì)胞器DNA、某些病毒DNA 。n3、線型單鏈DNA：某些病毒DNA，如：小鼠微小病毒n4、環(huán)狀單鏈DNA：某些病毒DNA，如：絲桿噬菌體fd11n質(zhì)粒（plasmid）：細(xì)菌中的染色體外的遺傳成分；為環(huán)狀雙鏈DNA分

4、子；為重組DNA技術(shù)中的有用工具。12、RNA的種類1、信使RNA （ mRNA）n占細(xì)胞總RNA的3%5%左右，含量最少；代謝活躍。在蛋白質(zhì)的生物合成中起模板作用。2、轉(zhuǎn)移RNA (tRNA) n占細(xì)胞總RNA的15%左右；細(xì)胞中最小的一種RNA分子。在蛋白質(zhì)的生物合成中起攜帶氨基酸和解譯的作用。133、核糖體RNA (ribosome RNA ，rRNA) n占細(xì)胞中總RNA80%左右，含量最大 。在蛋白質(zhì)合成中起催化作用，催化肽鍵的形成（可以說(shuō)，核糖體是一種核酶，蛋白質(zhì)只是維持rRNA構(gòu)象）。原核細(xì)胞中rRNA有三種，分別是：16SrRNA（小亞基），23SrRNA、5SrRNA（大亞基

5、） ；高等真核細(xì)胞中rRNA有四種，分別是： 18SrRNA （小亞基）， 28SrRNA、5.8SrRNA、5SrRNA （大亞基） 。14二、核酸的分布n1、DNA的分布n核（ 98 %） ；漿（ 2 %）n原核細(xì)胞：核區(qū)；細(xì)胞質(zhì)n真核細(xì)胞：細(xì)胞核；線粒體、葉綠體等細(xì)胞器n2、RNA的分布n核（%） 90n3、病毒或只含DNA，或只含RNA。15三、核酸的生物功能1、是主要的遺傳物質(zhì)2、RNA功能的多樣性n控制蛋白質(zhì)合成；n作用于RNA轉(zhuǎn)錄后加工與修飾；n基因表達(dá)與細(xì)胞功能的調(diào)控；n催化作用；n遺傳信息的加工與進(jìn)化；n在RNA病毒中是遺傳信息的一級(jí)載體返回16第三節(jié)、核酸的組成、結(jié)構(gòu)171

6、8一、核苷酸n包括核糖核苷酸（ RNA的結(jié)構(gòu)單位）和脫氧核糖核苷酸（ DNA的結(jié)構(gòu)單位）n細(xì)胞內(nèi)還有各種游離的核苷酸和核苷酸衍生物，它們有重要的生理功能。n如：FAD、CoA、NAD+、NADP+、腺苷鈷胺素19（一）堿基（base）1、嘧啶堿(pyrimidine base)n嘧啶的衍生物。n核酸中常見(jiàn)的嘧啶：胞嘧啶(cytosine,C) 、尿嘧啶(uracil,U) （ RNA ）、胸腺嘧啶(thymine,T) （ DNA ）。n胸腺嘧啶在tRNA中也有少量存在。2、嘌呤堿(purine base)n嘌呤的衍生物。n核酸中常見(jiàn)的嘌呤：鳥(niǎo)嘌呤(guanine,G)、腺嘌呤(adenine

7、,A)202-氧,4-氨基嘧啶5-甲基尿嘧啶2,4-二氧嘧啶6-氨基嘌呤2-氨基,6-氧嘌呤21n核酸中五種堿基中的酮基和氨基，均位于堿基環(huán)中氮原子的鄰位，可以發(fā)生酮式一烯醇式或氨基、亞氨基之間的結(jié)構(gòu)互變，書(shū)寫(xiě)時(shí)用任何一種皆可。n這種互變異構(gòu)在基因的突變和生物的進(jìn)化中具有重要作用 。223、稀有堿基（minorbase）（1）稀有堿基：又稱修飾堿基（modified base），稀有的微量堿基衍生物。（2）稀有堿基種類極多，大多數(shù)都是甲基化（m）堿基。n修飾基團(tuán)在堿基上的寫(xiě)在堿基符號(hào)左邊，修飾基團(tuán)在核糖上的寫(xiě)在堿基符號(hào)右邊，修飾基團(tuán)的位置寫(xiě)在右上角，數(shù)目寫(xiě)在右下角。（3）稀有堿基在各種類型核酸

8、中的分布不均一，在tRNA中含量較高（可高達(dá)10%）2324（二）核苷n1.核苷：由戊糖與堿基以糖苷鍵連接而成，是一種糖苷。n2.通常是戊糖的C1與嘧啶堿的N1或嘌呤堿的N9相連接。糖苷鍵為CN鍵，為N-糖苷鍵（核酸中均為-糖苷鍵）。n3.包括核糖核苷和脫氧核糖核苷。25n4.糖環(huán)中的碳原子標(biāo)號(hào)右上角加撇，而堿基中原子的標(biāo)號(hào)不加撇。n5、稀有核苷包括修飾核苷和異構(gòu)化核苷。n核糖也能被修飾，主要是甲基化；n稀有核苷主要在RNA中；n假尿苷：核糖的C1與尿嘧啶的C5相連。26（三）核苷酸1.核糖核苷的糖環(huán)上有3個(gè)自由羥基，能形成3種不同的核苷酸；n脫氧核糖核苷的糖環(huán)上有2個(gè)自由羥基，只能形成2種不

9、同的核苷酸；n生物體內(nèi)游離存在的核苷酸多是5-核苷酸。n用堿水解RNA時(shí)，可得到2-核糖核苷酸與3-核糖核苷酸的混合物。272.多磷酸核苷酸n種類： 5-二磷酸核苷（ 5- NDP）、 5 -三磷酸核苷（ 5- NTP）n功能：核酸合成的前體；重要的輔酶和能量載體。2829303、環(huán)化核苷酸n重要的有：cAMP、cGMP。n功能：細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)因子和信號(hào)分子。31cAMP的產(chǎn)生32二、核酸的共價(jià)結(jié)構(gòu)n核酸的共價(jià)結(jié)構(gòu)：即核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)，指核酸的核苷酸序列。（一）核酸中核苷酸的連接方式n3,5磷酸二酯鍵n書(shū)寫(xiě)順序：5 333n核酸共價(jià)結(jié)構(gòu)的表示方法：n豎線式表達(dá)法：用豎線代表戊糖，字母代表堿基；P

10、代表磷酸基團(tuán)n文字表示法：P在堿基左側(cè)，表示P在C5位置上， P在堿基右側(cè)，表示P與C3相連，書(shū)寫(xiě)順序5 3。5pCpApG334(二)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)nDNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)：構(gòu)成DNA的脫氧核苷酸按照一定的排列順序，通過(guò)3,5磷酸二酯鍵相連形成的線形結(jié)構(gòu)。也稱為堿基的排列順序。35（三）RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)1、tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)n3端皆為CpCpAOH。362、mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)（1）原核細(xì)胞：多順?lè)醋樱╟istron），即一條mRNA鏈上有多個(gè)編碼區(qū)，5端和3端各有一段非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）n順?lè)醋樱夯蚬δ艿膯挝唬痪幋a一條多肽鏈的一段染色體；一種結(jié)構(gòu)基因。37

11、（2）真核生物的mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)單順?lè)醋印?5端有帽子結(jié)構(gòu)：由甲基化鳥(niǎo)苷經(jīng)焦磷酸與mRNA的的5末端核苷酸相連，形成5，5-三磷酸連接。（圖）n三種類型：m7G5PPP5Np； m7G5PPP5NmpNp； m7G5PPP5NmpNmpNp三種。n作用：抗5核酸外切酶的降解作用；在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，有助于核糖體對(duì)mRNA的識(shí)別與結(jié)合，使翻譯得以正確起始。 3端有poly（A）：3端大約20250的聚腺苷酸，可能與mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸有關(guān)。38甲基鳥(niǎo)苷5，5-三磷酸 5-帽子：m7G 5 -ppp5-Nm（ Nm ）p-3940三、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)（一） Chargaff規(guī)則n關(guān)于D

12、NA堿基組成的規(guī)律，包括：n1.A=T；n2.G=C；n3.含氨基的堿基（A+C）=含酮基的堿基（G+T）n4.A+G=C+Tn暗示了A與T， G與C相互配對(duì)的可能性。nDNA堿基組成具有生物種的特異性。41（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1、雙螺旋結(jié)構(gòu)模型-Watson-Crick，1953：n兩條平行多脫氧核苷鏈以相反方向圍繞同一軸盤(pán)繞；兩條鏈都是右手螺旋（圖）。n兩條鏈配對(duì)偏向一側(cè)，形成一條大溝和一條小溝（圖） 。n堿基在螺旋內(nèi)，其平面與中心軸垂直；磷酸與核糖在外，由3，5-磷酸二酯鍵連接，糖環(huán)平面與中心軸平行（圖）。n螺旋平均直徑為2nm，堿基對(duì)的堆積距離為0.34nm，每10個(gè)核苷酸形成螺旋的

13、一轉(zhuǎn)（圖）。n兩條鏈由堿基對(duì)之間的氫鍵相連，在空間上可能的堿基對(duì)只有A與T（兩個(gè)氫鍵）以及G與C（三個(gè)氫鍵）（圖） 。42434445462、其他nDNA能以多種不同的構(gòu)象存在。n1.B-DNA：Watson-Crick雙螺旋，比較接近細(xì)胞正常狀態(tài)下DNA存在的構(gòu)象。n2. A-DNA：比較粗短，堿基傾角大一些，大溝深度明顯超過(guò)小溝。n3. Z-DNA：細(xì)長(zhǎng)，大溝平坦，磷酸和糖骨架呈Z字型；左手DNA螺旋。（圖）nDNA的變構(gòu)效應(yīng)可能與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。4748493、特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)(1) 回文結(jié)構(gòu)n回文結(jié)構(gòu)也稱反向重復(fù)（inverted repeats）50(2) 發(fā)夾形和十字形51

14、(3) H-DNA-三鏈螺旋524、維持DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力n氫鍵n雖然它只是一種作用較弱的次級(jí)鍵，但當(dāng)DNA分子中氫鍵數(shù)量眾多，仍可產(chǎn)生足夠的能量來(lái)維持DNA分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。n堿基堆積力n堿基堆積力實(shí)質(zhì)是疏水相互作用和范德華力。它對(duì)維持DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)起主要作用。53（三） DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)n1、DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)： DNA分子（雙螺旋）通過(guò)扭曲和折疊所形成的特定構(gòu)象。n2.超螺旋(superhelix) ：環(huán)狀雙鏈DNA或兩端固定的線形雙鏈DNA進(jìn)一步纏繞時(shí)形成的結(jié)構(gòu)； DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種形式；具有更致密的結(jié)構(gòu)。54n負(fù)超螺旋（negative superhelix） ：向DNA雙螺旋的相

15、反方向纏繞而成的超螺旋，又稱松弛纏繞；天然的超螺旋DNA均為負(fù)超螺旋；可使其二級(jí)結(jié)構(gòu)處于松散狀態(tài)，使分子內(nèi)部張力減少，利于DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和基因重組。n正超螺旋（positive superhelix） ：向DNA雙螺旋的相同方向纏繞而成的超螺旋，又稱緊密纏繞；使分子內(nèi)部張力加大，旋得更緊。55（四）DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)n生物體內(nèi)的核酸通常都與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，以核蛋白的形式存在。如：病毒、真核生物的染色體。56真核生物染色體的結(jié)構(gòu)n基本單位核小體（nucleosome):由DNA和組蛋白核心構(gòu)成；n組蛋白：H2A、H2B、H3、H4、 H1n核心由H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)組

16、成八聚體；nDNA以左手螺旋在組蛋白核心上盤(pán)繞1.8圈，共146bp，n核小體之間有連接DNA和組蛋白H1連接呈串珠狀結(jié)構(gòu)。（圖）5758四、RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)nRNA通常是單鏈線形分子，但可自身回折形成局部雙螺旋（二級(jí)結(jié)構(gòu)），進(jìn)而折疊（三級(jí)結(jié)構(gòu)）。除tRNA外，幾乎所有RNA都與蛋白質(zhì)形成核蛋白復(fù)合物（四級(jí)結(jié)構(gòu)）nRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)：?jiǎn)捂淩NA自行盤(pán)繞形成局部雙螺旋的多“莖”多“環(huán)”結(jié)構(gòu)。螺旋部分稱為“莖”或“臂”；非螺旋部分稱為“環(huán)”；在螺旋區(qū)，A與U配對(duì)，G與C配對(duì)。（圖）5960（一）tRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)1、tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（1）形狀：三葉草形。（2）組成：4臂4環(huán)組成n4臂：氨基酸接受臂、

17、反密碼臂、二氫尿嘧啶臂、TC臂。n4環(huán)：反密碼環(huán)（次黃嘌呤I核苷酸常出現(xiàn)于反密碼子中）、二氫尿嘧啶環(huán)、TC環(huán)和額外環(huán)（大小不同， tRNA分類的重要指標(biāo)）（圖）6162n（1）氨基酸臂：由7對(duì)堿基組成，富含鳥(niǎo)嘌呤，末端為CCA，接受活化的氨基酸。n（2）二氫尿嘧啶環(huán)：由812個(gè)核苷酸組成，具有兩個(gè)二氫尿嘧啶，故得名。n（3）反密碼環(huán)：由7個(gè)核苷酸組成。環(huán)中部為反密碼子，由3個(gè)堿基組成。次黃嘌呤核苷酸（I）常出現(xiàn)于反密碼環(huán)中。n（4）額外環(huán)：有318個(gè)核苷酸組成。不同的tRNA有不同大小的額外環(huán)，故可作為tRNA分類指標(biāo)。n（5）TC環(huán)：由7個(gè)核苷酸組成。幾乎所有tRNA在此環(huán)中都含有TC。63

18、2、tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)n倒“L”形，所有的tRNA折疊后形成大小相似及三維構(gòu)象相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 64（二）rRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)大腸桿菌16SrRNA和5SrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)返回65第四節(jié)、核酸的理化性質(zhì)一、核酸的水解（一）核酸的酸解n糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸水解；66 n糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被酸水解；n嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對(duì)酸更不穩(wěn)定；n對(duì)酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。如：nDNA在pH1.6于37對(duì)水透析，可完全除去嘌呤堿，得到無(wú)嘌呤酸（apurinic acid）。67（二）堿水解n1、RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸。n原因： RNA的核糖上有2-OH羥基，在堿

19、作用下形成磷酸三酯；磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解，產(chǎn)生核苷2，3-環(huán)磷酸酯；環(huán)磷酸酯繼續(xù)水解，產(chǎn)生2-核苷酸和3-核苷酸。（圖）n2、 DNA的磷酸酯鍵不易被堿水解， DNA一般對(duì)堿穩(wěn)定。6869（三）酶水解1、水解核酸的酶（1）磷酸二酯酶：非特異性水解磷酸二酯鍵的酶。n催化寡核苷酸及多核苷酸中雙重酯化的磷酸分子進(jìn)行水解的酶類。如：3，5-cAMP磷酸二酯酶。（2）核酸酶（nuclease）：專一水解核酸的磷酸二酯酶。702、核酸酶的分類（1）按照對(duì)底物作用的方式n核酸內(nèi)切酶（endonuclease）和核酸外切酶（exonuclease）（2）按照磷酸二酯鍵斷裂的方式n在3-羥基與磷酸基之間斷

20、裂n在5-羥基與磷酸基之間斷裂71（3）按照底物專一性n核糖核酸酶（RNase）和脫氧核糖核酸酶（DNase）723、限制性內(nèi)切酶n限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease）：簡(jiǎn)稱限制酶（restriction enzyme）；存在于原核生物中；催化對(duì)外源DNA的降解；識(shí)別DNA中特異的堿基序列，將DNA分子剪切為數(shù)量不多的片段（限制性片段）；為基因工程最重要的工具酶。73n限制性內(nèi)切酶的特征 具有嚴(yán)格的堿基專一性，有專一的識(shí)別順序、切點(diǎn) 粘性未端，平整末端74舉例: 75二、核酸的酸堿性質(zhì)n核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質(zhì)，為兩性電解質(zhì)。

21、n核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點(diǎn)偏酸性。DNA的pI約為45，RNA的pI約為2.02.5，在pH78電泳時(shí)泳向正極。76三、核酸的紫外吸收（一）核酸的紫外吸收特性n嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。77（二）核酸的紫外吸收特性的應(yīng)用1. 作為定量測(cè)定核酸的方法。2. 鑒定核酸樣品的純度。A260/A280比值：純DNA=1.8；純RNA=2.0；樣品中含有雜蛋白， A260/A280比值明顯降低。3.可判斷核酸是否發(fā)生變性或降解。增色效應(yīng)（hyperchromic effect）：當(dāng)核酸

22、變性或降解時(shí)，其紫外線吸收強(qiáng)度顯著增高減色效應(yīng)（hypochromic effect）：變性的核酸在一定條件下恢復(fù)原有性質(zhì)時(shí)，其紫外線吸收強(qiáng)度又可回復(fù)到原有水平。n雙螺旋結(jié)構(gòu)使堿基對(duì)的電子云發(fā)生重疊，減少了對(duì)紫外光的吸收。78四、核酸的變性、復(fù)性和雜交（一）核酸的變性(denaturation)1、核酸的變性：核酸雙鏈螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵的斷裂。n與核酸的降解區(qū)別開(kāi)。2、引起核酸變性的因素n加熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)試劑（尿素、甲醛、甲醇、乙醇、甲酰胺等）或射線等一切可以破壞核酸分子氫鍵的處理，都可使核酸變性。3、變性DNA的特征n紫外吸收增強(qiáng)；粘度降低；浮力密度升高；比旋下降

23、；生物功能減小或消失等。794、DNA的熱變性nDNA熱變性是在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。nDNA的融解溫度(Tm)：或稱熔點(diǎn)，在核酸加熱變性過(guò)程中，核酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)的溫度，又稱為核酸的解鏈溫度。（即在260nm下光吸收達(dá)到最大光吸收一半是的溫度）nDNA的Tm值一般在8295之間。80n與Tm值有關(guān)的因素n GC所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān)n經(jīng)驗(yàn)公式： Tm=69.30.41(G+C)%n或（G+C）%=（ Tm-69.3）2.44n離子強(qiáng)度n溶液的離子強(qiáng)度較低時(shí)，Tm值較低，融點(diǎn)范圍也較寬。因此，DNA制劑不應(yīng)保存在離子強(qiáng)度過(guò)低的溶液中。 n均一性n均質(zhì)DNA：熱變性

24、溫度范圍較??；n異質(zhì)DNA：熱變性溫度范圍較寬。815. RNA的變性n轉(zhuǎn)變不如DNA明顯，隨著溫度的升高， RNA 中雙鏈部分的堿基堆積會(huì)逐漸減少，吸光值逐漸地、不規(guī)則地增大； nTm值較低。82（二）核酸的復(fù)性1、DNA的復(fù)性：變性因素解除后，因變性而分開(kāi)的DNA兩條單鏈即可再聚合成原來(lái)的雙螺旋，其原有的性質(zhì)，可得到部分恢復(fù)。832、DNA的復(fù)性主要制約因素（1）降溫速度n復(fù)性時(shí)溫度下降必須是一緩慢過(guò)程，若在超過(guò)Tm的溫度下迅速冷卻至低溫，復(fù)性幾乎是不可能的。n退火(annealing)：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱之為。（2）DNA濃度濃度較高時(shí)，易于復(fù)性。（3）DNA

25、片段的大小DNA片段越大，復(fù)性越慢。（4）基因組大小具有很多重復(fù)序列的DNA，復(fù)性較快。84（三）核酸的雜交n1.核酸的雜交（hybridization）：不同來(lái)源的核酸變性后，合并在一處進(jìn)行復(fù)性；這時(shí)，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補(bǔ)配對(duì)的片段，復(fù)性也會(huì)發(fā)生于不同來(lái)源的核酸鏈之間，即形成所謂的雜化雙鏈。n雜交可以發(fā)生于DNA與DNA之間，也可以發(fā)生于RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。返回85第五節(jié)、核酸的研究方法一、核酸的分離、提純（一） DNA的分離n目前最重要的方法有3個(gè)：n1. 鹽抽提，用苯酚或氯仿除去蛋白質(zhì)。n預(yù)處理：細(xì)胞破碎n鹽的作用：核蛋白（DNP）溶于濃鹽

26、溶液（如1M氯化鈉），但不溶于生理鹽溶液（如0.14M氯化鈉）n苯酚或氯仿的作用：為蛋白質(zhì)變性劑，除去蛋白質(zhì)。862.用廣譜蛋白酶在SDS存在下保溫消化細(xì)胞懸液，再用苯酚或氯仿除去蛋白質(zhì)，用RNase除去少量RNA。3.氯化銫密度梯度離心法。n使用超速離心機(jī)。n氯化銫密度梯度：氯化銫在水介質(zhì)中有極高溶解度；將8.0M的氯化銫溶液裝入離心杯中，開(kāi)動(dòng)離心機(jī)，形成線形氯化銫密度梯度，自杯底的1.80g/cm3到頂部的1.55 g/cm3。n當(dāng)DNA樣品的沉降速度與擴(kuò)散速度達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)， DNA形成一穩(wěn)定的區(qū)帶，漂浮于氯化銫密度梯度中的一定位置。n用注射針頭從離心管側(cè)面一定部位刺入，收集這一區(qū)帶的DNA。87（二） RNA的分離nRNA比DNA更不穩(wěn)定，而且RNase又無(wú)處不在，因此RNA的分離更難。1、防止RNase降解的方法（1）器皿要高溫、高壓處理或用DEPC除去RNase；nDEPC：焦碳酸