采用離子色譜法對黃酒中氨基酸的比較研究

1、采用離子色譜法對黃酒中氨基酸的比較研究諸葛慶，李博斌，劉興泉，鄭云峰（國家黃酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心 紹興 312071）摘要：準(zhǔn)確測定黃酒中的氨基酸對研究黃酒的營養(yǎng)價值和黃酒風(fēng)味具有重要的意義，本研究采用了陰離子交換色譜法-積分脈沖安培檢測法測定了江西、紹興、福建三地黃酒中的氨基酸。分析結(jié)果顯示，紹興黃酒、福建黃酒的氨基酸總量較高，平均含量分別是3946.56mg/L、3726.80 mg/L，江西黃酒氨基酸含量為1634.33 mg/L，每種黃酒的呈味氨基酸以甜味氨基酸和苦味氨基酸為主，它們占80%左右。關(guān)鍵詞：陰離子交換色譜法；積分脈沖安培檢測；氨基酸；黃酒黃酒是我國的民族特產(chǎn)，黃酒是以稻

2、米、黍米、玉米、小米、小麥等糧食為主要原料，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、貯存、勾兌等工藝生產(chǎn)的釀造酒。黃酒酒精度低、耗糧較少、富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素和對人體有益的礦物元素，營養(yǎng)豐富1。黃酒中含有多種多量的氨基酸，黃酒中的氨基酸主要是曲霉菌的酸性蛋白霉和酸性羧肽酶對蒸煮后的原料米中的蛋白質(zhì)起作用而產(chǎn)生的，是黃酒中的主要成分之一，不僅是黃酒的營養(yǎng)成分，也是黃酒的風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味的前驅(qū)體，對黃酒的風(fēng)味起著重要作用2,3。氨基酸具有鮮、甜、苦、澀等多種味感，賦予了黃酒豐富的味覺層次，使黃酒具有鮮美、醇和、濃郁、柔潤、協(xié)調(diào)和多滋多味的特征4。黃酒中的呈味氨基酸與黃酒的風(fēng)味有著很大的聯(lián)系，因此準(zhǔn)

3、確的對黃酒中的氨基酸進(jìn)行定性和定量分析是非常有必要的。但是氨基酸種類繁多、性質(zhì)接近，氨基酸分析是色譜界公認(rèn)的難題?，F(xiàn)在常用的方法有離子交換色譜法，基于反相色譜分離、柱前衍生、熒光或紫外檢測的高效液相法，陰離子交換分離直接安培法檢測的離子色譜法，衍生化氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法，這些方法在檢測氨基酸方面還存在一定的不足。本研究所用的高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法（HPAEC-IPAD）是一種新的氨基酸分析方法5。此方法是基于氨基酸分子中的羧基在強堿性介質(zhì)中可以形成陰離子，而氨基酸分子中的氨基在強堿性介質(zhì)中通過施加一定的電位，可在貴金屬（金、鉑）電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，從而實現(xiàn)氨基酸的陰離子交

4、換色譜分離和積分脈沖安培檢測6,7,8。1 實驗部分1.1儀器和試劑美國Dionex DX-600型離子色譜儀，配有GS50四元梯度泵，AS40自動進(jìn)樣器，AS50色譜柱室，ED50電化學(xué)檢測器，Peak Net色譜工作站。17種氨基酸混合標(biāo)樣，乙酸鈉（Dionet,USA），氫氧化鈉、疊氮化鈉為分析純。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用20mg/L疊氮化鈉水溶液配制成氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。淋洗液：去離子水、0.25mol/LNaOH、1.0mol/LNaAc。1.2色譜條件色譜柱：AminoPac PA10陰離子交換柱，包括分析柱（2×250mm）和保護(hù)柱（2×50mm）。淋洗條件：采用梯度洗

5、脫，梯度淋洗條件見表1，流速：0.25mL/min。檢測條件：積分脈沖安培法檢測。柱溫：30。進(jìn)樣體積：25mL表1 分離氨基酸的梯度淋洗程序Time(min)Water(%)0.25 mol/LNaOH(%)1 mol/LNaAC(%)Curve0.09372.0901055.08515811.06436813.0643615.06040820.03070825.0307025.127703833.023707838.0207010845.0107020850.0103060860.01030601.3 樣品前處理樣品在分析前用去離子水稀釋500倍，經(jīng)過0.45µm的濾膜過濾直接進(jìn)

6、樣分析。 結(jié)果與討論2.1氨基酸的色譜分離實驗所測定17種氨基酸標(biāo)樣色譜圖見圖1。圖1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖從圖1中可以看出，17種氨基酸在選定的分離條件下可以達(dá)到很好的分離。2.2方法的檢出限、線性范圍及回收率根據(jù)以上的分離條件，對氨基酸的混合標(biāo)樣進(jìn)行測定，得出了該方法的檢出限、線性范圍，同時還分析了各種氨基酸的回收率，所得的數(shù)據(jù)見表2。表2方法的檢出限、線性范圍及回收率化合物名稱檢出限mol/L回歸方程相關(guān)系數(shù)線性范圍mol/L加入量mol/L實測值mol/L回收率%精氨酸0.00950.99900.2205.004.9398.6賴氨酸0.05890.32X+0.110.99890.2202.5

7、02.57102.8丙氨酸0.02091.01X+0.990.99760.22010.009.6996.9蘇氨酸0.00912.28X+0.320.99920.2202.502.55102.0甘氨酸0.02121.10X+0.010.99950.2205.004.8997.8纈氨酸0.02541.31X+0.650.99850.2204.003.7593.8絲氨酸0.00782.49X+0.550.99940.2204.004.03100.8脯氨酸0.01621.29X+0.910.99820.2208.008.09101.1異亮氨酸0.04590.58X+0.420.99970.2202.5

8、02.53101.2亮氨酸0.06010.61X+0.530.99940.2205.005.13102.6蛋氨酸0.01382.07X+0.970.99650.2201.000.9595.0組氨酸0.00614.56X+0.430.99810.2201.000.9393.0苯丙氨酸0.01390.99990.2204.003.8997.2谷氨酸0.25790.20X+0.050.99981.0204.003.8596.2天冬氨酸0.06980.18X+0.610.99910.2205.004.7394.6胱氨酸0.00440.99690.2201.000.9696.0酪氨酸0.00601.97

9、X+0.890.99920.2202.502.57102.8由表2可知，該方法對17種氨基酸的檢測具有較低的檢出限、較寬的線性范圍和較高的回收率，較高的回收率也說明了用該方法檢測黃酒中的氨基酸所得到的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確可靠的。2.3 黃酒中氨基酸的分析隨意選取了江西、紹興及福建三個省份的各5種黃酒樣品進(jìn)行檢測，以保留時間定性、外標(biāo)法定量，所得到的樣品圖譜見圖2，分析結(jié)果見表3、表4及表5。由譜圖2可見，在以上所選定的色譜條件下，樣品中的17種氨基酸具有良好的分辨率和重現(xiàn)性。圖2 黃酒中氨基酸分析譜圖表3 江西黃酒氨基酸分析結(jié)果（單位：mg/l）氨基酸樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5平均值甜味氨基酸甘氨酸

10、Gly92.2662.3375.3361.1990.4976.32 丙氨酸Ala220.37165.32211.21149.96444.92238.36 脯氨酸Pro197.5084.83196.16137.50137.40150.68 絲氨酸Ser104.2973.0689.0019.2690.2175.16 蘇氨酸Thr71.8065.2257.0411.9750.6751.34 胱氨酸cys11.5621.1016.0018.386.0114.61 蛋氨酸Met31.9841.5022.567.7345.7829.91 729.76513.36667.3405.99865.48636.3

11、8 苦味氨基酸組氨酸His52.0930.5736.8320.8817.9131.66 精氨酸Arg146.5593.42204.6056.2517.61103.69 纈氨酸Val115.0284.3884.1323.23122.2085.79 異亮氨酸Ile82.1469.3054.0514.6088.1761.65 亮氨酸Leu208.09193.16235.4752.85261.74190.26 苯丙氨酸Phe117.89114.12168.7051.79174.88125.48 賴氨酸Lys127.3080.90105.5625.8510.3269.99 849.08665.85889

12、.34245.45692.83668.51 鮮味氨基酸天冬氨酸Asp139.74106.33145.4413.5229.1586.84 谷氨酸Glu175.25313.59148.9486.44110.77167.00 314.99419.92294.3899.96139.92253.83 澀味氨基酸酪氨酸Tyr103.6088.44142.6337.366.0075.61 總氨基酸1997.431687.571993.65788.771704.221634.33以上五種江西黃酒樣品均以紅米為原料釀制而成，從表3可以看出，不同樣品的黃酒其氨基酸含量是有差別的，氨基酸含量最高能達(dá)到1997.43

13、 mg/l，最低只有788.77mg/l，這是因為黃酒中的氨基酸主要是曲霉菌的酸性蛋白霉和酸性羧肽酶對蒸煮后的原料米中的蛋白質(zhì)起作用而產(chǎn)生，因此原料中蛋白質(zhì)含量的不同及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率的高低是決定黃酒中氨基酸含量的主要因素，但是氨基酸的含量過低也有可能是由于勾兌所造成。從分析結(jié)果還可以看出，以上五種黃酒中的呈味氨基酸以甜味氨基酸和苦味氨基酸的種類居多、含量為主。 表4 紹興黃酒氨基酸分析結(jié)果（單位：mg/l）氨基酸樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5平均值甜味氨基酸甘氨酸Gly274.30176.35203.72273.71230.06231.63 丙氨酸Ala490.08353.58410.01503

14、.59424.04436.26 脯氨酸Pro800.11588.15527.32771.96678.51673.21 絲氨酸Ser236.88131.94133.73234.04180.63183.44 蘇氨酸Thr190.5085.6888.81142.00101.96121.79 胱氨酸cys26.3113.5017.1828.8322.5221.67 蛋氨酸Met3.512.1326.995.011.957.92 2021.691351.331407.761959.141639.671675.92 苦味氨基酸組氨酸His71.0854.8372.6041.9171.3362.35 精氨酸

15、Arg423.31433.760.00527.90469.05370.80 纈氨酸Val224.96149.57194.66234.11186.35197.93 異亮氨酸Ile173.17122.67135.55172.59144.22149.64 亮氨酸Leu428.04295.67322.44431.36355.41366.58 苯丙氨酸Phe314.62206.91251.65301.23231.03261.09 賴氨酸Lys233.00202.66197.99242.81206.04216.50 1868.181466.071174.891951.911663.431624.90 鮮味

16、氨基酸天冬氨酸Asp304.89157.28154.75265.47208.40218.16 谷氨酸Glu219.93154.85211.56162.70190.02187.81 524.82312.13366.31428.17398.42405.97 澀味氨基酸酪氨酸Tyr261.73198.95248.19278.89211.10239.77 總氨基酸4676.423328.483197.154618.113912.623946.56 紹興酒是中國黃酒的杰出代表，以糯米為原料發(fā)酵釀制而成的麥曲稻米酒，其芬芳醇厚，色香味俱佳9。從上表對氨基酸分析的結(jié)果來看，五種黃酒氨基酸的含量都比較高，呈味

17、氨基酸還是以甜味氨基酸和苦味氨基酸為主，它們的含量超過了80%。黃酒甜味氨基酸與米和麥曲經(jīng)酶的水解所產(chǎn)生的以葡萄糖、麥芽糖等糖類物質(zhì)賦予了黃酒滋潤、豐滿、濃厚的內(nèi)質(zhì)；黃酒的苦味，主要來自發(fā)酵過程中所產(chǎn)苦味氨基酸與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的甲硫基腺苷和胺類等物質(zhì)及糖色，恰到好處的苦味，使味感清爽，給酒帶來一種特殊的風(fēng)味；黃酒中的鮮味，來自眾多氨基酸中的鮮味氨基酸以及蛋白質(zhì)水解所產(chǎn)生的多肽及含氮堿，為黃酒所特有。黃酒的澀、苦兩味同時產(chǎn)生的，主要由乳酸、酪氨酸、異丁醇和異戊醇等成分構(gòu)成，苦、澀味適當(dāng)，不但不會使酒呈明顯的苦澀味，反而能使酒味有濃厚的柔和感。因此準(zhǔn)確分析黃酒中的氨基酸對研究氨基酸對黃酒風(fēng)味的影響

18、是非常有意義的。表5 福建黃酒氨基酸分析結(jié)果（單位：mg/l）氨基酸樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5平均值甜味氨基酸甘氨酸Gly216.5998.31136.69257.39276.41197.08 丙氨酸Ala475.66249.09315.24718.21488.89449.42 脯氨酸Pro279.58157.63390.78496.81389.19342.80 絲氨酸Ser186.2084.80145.88294.21300.67202.35 蘇氨酸Thr78.1540.5995.20252.72177.27128.79 胱氨酸cys10.861.5117.2826.6025.8816.

19、43 蛋氨酸Met9.8015.9840.0273.2994.7846.77 1256.84647.911141.092119.231753.091383.63 苦味氨基酸組氨酸His62.7343.1071.6164.66108.6670.15 精氨酸Arg239.70152.97302.15452.01410.05311.38 纈氨酸Val134.4883.34132.57324.46271.94189.36 異亮氨酸Ile109.5765.73108.35223.79182.29137.95 亮氨酸Leu360.14157.64249.70564.69463.64359.16 苯丙氨酸P

20、he209.4993.01148.73220.54281.93190.74 賴氨酸Lys234.85121.82205.24268.49272.38220.56 1350.96717.611218.352118.641990.891479.29 鮮味氨基酸天冬氨酸Asp297.7898.74162.50522.44325.69281.43 谷氨酸Glu297.01295.67701.13340.94416.78410.31 594.79394.41863.63863.38742.47691.74 澀味氨基酸酪氨酸Tyr176.0374.05141.36214.04255.21172.14 總氨

21、基酸3378.631833.993364.435315.304741.653726.80福建黃酒又名紅曲黃酒，利用耐高溫紅曲釀制的紅曲稻米黃酒10。從對福建黃酒氨基酸的分析結(jié)果來看，個別黃酒氨基酸的含量比較高，達(dá)到5315.30 mg/l，它與含量最低的相差了3481.31 mg/l，福建黃酒中的氨基酸與紹興黃酒的氨基酸一樣，也是以甜味氨基酸和苦味氨基酸為主，而且甜味氨基酸與苦味氨基酸的含量差別不大。3 結(jié)論氨基酸是黃酒的重要組成物質(zhì)，在黃酒口感和營養(yǎng)作用中扮演著重要的角色。長期以來，由于氨基酸的特殊性，其定量技術(shù)成為深入研究的難點。本研究采用陰離子交換色譜測黃酒中氨基酸，利用不同氨基酸之間的

22、陰離子交換色譜的保留行為存在差異，從而實現(xiàn)了用陰離子交換色譜-積分脈沖安培法分離、測定黃酒中的氨基酸。該檢測方法只要對酒樣進(jìn)行簡單的稀釋和過濾，即可進(jìn)行分析，操作簡單，成本低，大大提高了氨基酸分析的效率和能力。從對三個地方的黃酒分析結(jié)果來看，每種黃酒的氨基酸種類及含量都是以甜味氨基酸和苦味氨基酸為主，它們的含量占80%左右。但是由于所用的原料及釀造的工藝不同，不同地方生產(chǎn)的黃酒其氨基酸的含量有所不同，其中紹興黃酒及福建黃酒的氨基酸總量相對比較高，分別是3946.56 mg/l、3726.80 mg/l，江西黃酒的氨基酸含量相對較低，為1634.33 mg/l。黃酒就其呈味氨基酸的主體而言，都是

23、以甜味氨基酸和苦味氨基酸為主，但是由于所用的原料及釀造工藝的差異，不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的黃酒其氨基酸的含量還是存在一定差別的。盡管氨基酸與黃酒的營養(yǎng)價值及風(fēng)味有很大的聯(lián)系，但是黃酒是一個復(fù)雜的體系，評價黃酒酒質(zhì)的好壞還需綜合考慮其它方面的因素。參考文獻(xiàn)1. 汪建國, 徐亮.(2005) 我國黃酒的特征及展望. 江蘇調(diào)味副食品，22(6),5-92. 汪建國. (2004) 黃酒中的色、香、味、體的構(gòu)成和來源分析. 中國釀造, (4), 6-10, 183. 李家壽. (2001) 黃酒色、香、味成分來源淺析. 釀酒科技, (3), 48-504. 楊國軍. (2003)黃酒中苦味物質(zhì)及其來源探討. 釀酒,30 (3), 44-465. 于泓, 丁永勝, 牟世芬. (2002) 陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法分