分子實(shí)驗(yàn)常見問題及對(duì)策

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常見問題分析及對(duì)策一、各種常見 PCR1. PCR反應(yīng)擴(kuò)不出條帶，出現(xiàn)假陰性，可能原因：（1）模版：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，且含量低；Buffer對(duì)樣品不合適；引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解；模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。（2）酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙

2、錠。（3）引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引

3、物之間形成二聚體等。（4）Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。（5）物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。

4、有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。解決方案：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量；更換Buffer或調(diào)整濃度；重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物；降低退火溫度、延長延伸時(shí)間。2 出現(xiàn)假陽性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶不一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基

5、因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。3.非特異性擴(kuò)增PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其可能原因：引物特異性差，

6、引物形成二聚體；模板或引物濃度過高；酶量過多；Mg2+濃度偏高；退火溫度偏低；循環(huán)次數(shù)過多。解決方案：重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR；適當(dāng)降低模板或引物濃度；適當(dāng)減少酶量；降低鎂離子濃度；適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)，減少循環(huán)次數(shù)。4.出現(xiàn)片狀拖帶或抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，模板不純；Buffer不合適；dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。解決方案：純化模板；更換Buffer；適當(dāng)提高退火溫度；適量用酶；適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度；減少循環(huán)次數(shù)。二、電泳1.DNA帶

7、模糊可能存在的原因和解決方法：1)電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，故需經(jīng)常更換電泳緩沖液。2)所用電泳條件不合適：電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度30；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)15，同時(shí)核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。3)DNA上樣量過多：減少凝膠中DNA上樣量。4)DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。5)有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。6)DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。7)DNA降解：應(yīng)避免核酸酶污染。2.不規(guī)則DNA帶遷移可能存在的原因和解決方法： 1)對(duì)于/Hin

8、d III片段cos位點(diǎn)復(fù)性：電泳前于65加熱 DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。2)電泳條件不合適：電泳電壓不超過20V/cm；溫度30；經(jīng)常更換電泳緩沖液。3)DNA變性：出現(xiàn)不規(guī)則DNA帶遷移可能是由于DNA變性引起的。當(dāng)緩沖液電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致DNA變性。選擇合適的緩沖液可以解決這個(gè)問題，此外，以20mM NaCl 緩沖液稀釋 DNA，電泳前勿加熱。也可以緩解這一問題。3.帶弱或無DNA帶可能存在的原因和解決方法： 1) DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量，但聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低。2) DNA降解：應(yīng)避免DNA的核酸酶污染。3)

9、樣品分子量不在膠允許范圍內(nèi)。建議另外配置合適的膠。4) 提取不干凈或緩沖液有問題。5) DNA走出凝膠：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。6) 對(duì)于EB染色的DNA，所用光源不合適：應(yīng)用短波長（254nm）的紫外光源。7) 對(duì)于提取的質(zhì)粒跑電泳，可能菌的問題，菌種是否正確，有沒有確信加了抗生素，質(zhì)粒拷貝數(shù)高不高，菌量夠不夠然后提取的時(shí)候，試劑盒牌子質(zhì)量過不過硬，有沒有過期，裂解是不是完全，會(huì)不會(huì)SDS或者高鹽都結(jié)晶沉淀了，所有溶液有沒有加錯(cuò)，比如說柱分離，漂洗液里面有沒有確信加了酒精，洗脫時(shí)候洗脫液假如用的是純水，有沒有調(diào)過pH值，加的量夠不夠，有沒有完全浸潤硅膠膜。4.DNA帶缺失可能存

10、在的原因和解決方法：1)小DNA帶走出凝膠：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。2)分子大小相近的DNA帶不易分辨：增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度。3)DNA 變性：用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA，電泳前勿加熱。4)DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適：改在脈沖凝膠電泳上分析。5.重復(fù)性不好可能存在的原因和解決方法：1）凝膠制備的不規(guī)范：按要求嚴(yán)格操作。2）凝膠放置過久：聚合時(shí)間不能太長或太短，分離膠不過一周，間隔膠當(dāng)日用。6. DNA電泳的MARKER帶扭曲可能存在的原因和解決方法：1）配制膠時(shí)的緩沖液和電泳緩沖液不是同時(shí)配制的：最好是同時(shí)配制。電泳時(shí)緩沖液高過液面1-2mm即可。2）

11、電泳時(shí)電壓過高：可以在電泳前15分鐘用較低電壓(3V/cm)，等條帶出孔后再調(diào)電壓。3）上樣時(shí)盡量慢慢加樣，等樣品自然沉降后再加電壓。7. marker條帶非常模糊，無法辨別具體條帶的原因（1）marker條帶出現(xiàn)了降解。請確保在使用過程中避免核酸酶污染；（2）電泳緩沖液陳舊。電泳緩沖液多次使用后，離子濃度降低，ph值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液；（3）電泳條件不合適。電泳時(shí)電壓應(yīng)不超過20v/cm，溫度應(yīng)低于30；（4） marker上樣量過多。請根據(jù)說明書選用合適上樣量；（5）凝膠質(zhì)量不好。建議使用質(zhì)量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會(huì)導(dǎo)致條帶模糊。8.

12、 DNA帶相近不易分辨當(dāng)DNA的分子大小比較相近時(shí)，會(huì)在電泳結(jié)果中出現(xiàn)DNA帶不易分辨的情況。這時(shí)可以通過增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度來提高分辨度。9.做PCR電泳后跑電泳，目的基因是489bp 的，結(jié)果每次切膠回收后再跑電泳就變成500多bp了，有時(shí)快到600bp了？為什么？答：有時(shí)只靠電泳結(jié)果判斷是不準(zhǔn)確的，同樣的片段每次跑的遠(yuǎn)近會(huì)有不同。有經(jīng)驗(yàn)顯示目的片段是1300多，結(jié)果就跑到1000的marker下面去了，后來證實(shí)片段沒有問題。也有做的一個(gè)片段也是這樣，是490BP.理論上兩個(gè)條帶一樣，可是PCR結(jié)果顯示就是大小不一致。然后回收以后的檢測結(jié)果又全部都一樣了，后來又拿去做了下一個(gè)測

13、序，才知道根本沒有問題。另外，對(duì)于提大腸桿菌質(zhì)粒后跑瓊脂糖凝膠電泳無條帶出現(xiàn)？在確定瓊脂糖凝膠電泳無問題的前提下，那應(yīng)該就是質(zhì)粒提取有問題。首先看質(zhì)粒是高拷貝還是低拷貝的質(zhì)粒，一般低拷貝的質(zhì)粒5ml的，高拷貝的質(zhì)粒2-3ml小劑量提取。量不能過大，否則影響提取。第二點(diǎn)，加入裂解液如SDS-NaOH后，時(shí)間不宜超過5min，因?yàn)榇瞬襟E的目的是使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放，蛋白質(zhì)，染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性，時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致加入中和裂解液如酸性醋酸鉀后，仍無法使質(zhì)粒DNA復(fù)性。導(dǎo)致提取失敗。三、膠回收、純化1. 切膠的時(shí)候如何能切的準(zhǔn)？條帶的位置肉眼很難判斷出來，如何判斷條帶的位置？ 可以將產(chǎn)物與Marke

14、r一起電泳，染色后，在紫外燈下觀察結(jié)果，跟Marker進(jìn)行相比，就知道要的是哪條帶。注意，紫外燈下切膠速度要快，否則DNA會(huì)降解，另外，紫外線對(duì)身體傷害很大，特別是眼睛，請注意采取保護(hù)措施（比如在專門的箱子里切，帶眼鏡等）。RNA 用具要用10%的NaOH浸泡過液，再用DEPC水沖洗干凈70%的乙醇用過國產(chǎn)分析乙醇有雜質(zhì)，RNA酶還會(huì)有，并帶入其它污染。2. 凝膠回收DNA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵在哪里? 最關(guān)鍵的是切膠之后，溶膠的那一步。切膠的時(shí)候要盡量把多余的瓊脂糖凝膠切干凈，按照實(shí)驗(yàn)步驟，第一步應(yīng)該是將膠充分的溶化。這以后步一定要做充分，保證凝膠已經(jīng)完全溶解了。加乙醇這步也很關(guān)鍵，當(dāng)凝膠溶解后最好多過

15、幾次柱子。還有就是洗脫的那一步。洗脫的時(shí)候最好用加熱到60度的洗脫液洗脫，如果實(shí)在效果不好可以分兩次洗脫。3. 跑完P(guān)CR，暫時(shí)不方便膠回收，條帶已經(jīng)切下來放到 EP 管里了，能保存么？ 割下來的膠放在-20保存兩個(gè)星期完全沒有問題。切下來的膠放在4冰箱中4-5小時(shí)沒有問題，回收的效果也很好。4. 回收得片段為什么電泳上樣會(huì)漂起來？主要問題是純化過程中的乙醇沒有除干凈。注：DNA回收中常出現(xiàn)的問題5.利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片斷？可能存在的原因和解決方法：1) 膠塊未完全溶解：可適當(dāng)延長水浴時(shí)間，并增加上下顛倒次數(shù)輔助溶解。2) 膠塊體積太大，應(yīng)使用槍頭搗碎，還不能

16、充分溶解則先將其切為小塊，分多次回收；3) 紫外燈下切膠時(shí)間過長，導(dǎo)致DNA部分降解，應(yīng)盡量把切膠時(shí)間控制在30s以內(nèi)；4) 電泳緩沖液pH太高：硅基質(zhì)膜在高鹽低pH結(jié)合DNA，如pH太高，應(yīng)作適當(dāng)調(diào)整。5) 漂洗液中未加入無水乙醇。或是洗滌液使用后未及時(shí)蓋嚴(yán)瓶蓋，乙醇揮發(fā)，影響回收效率；6) 外緣DNA污染：在紫外燈下切下含待回收的DNA的凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片。7) 改用去離子水洗脫，但是實(shí)驗(yàn)室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當(dāng)提高其pH值，以增加洗脫得率。8) 不可以使用更小的洗脫體積（小于說明書提供的最小洗脫體積）進(jìn)行洗脫以提高濃度，因?yàn)檎f明書上提

17、供的最小洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積，若減少體積則不能將DNA完全洗脫下來。9）回收前的樣品量太少，加大點(diǎn)樣量；10）TAE或TBE電泳緩沖液不新鮮，失去了緩沖能力，導(dǎo)致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，應(yīng)及時(shí)更換電泳緩沖液，最好使用新鮮配制的電泳緩沖液，效果更好；11）洗脫前，預(yù)先65預(yù)熱洗脫液、延長室溫靜置時(shí)間、增加洗脫次數(shù)可以有效提高回收率30%以上。6. DNA回收時(shí)，瓊脂糖凝膠膠塊不溶，如何處理？可能存在的原因和解決方法：1)瓊脂糖質(zhì)量不好。2)含目的片斷的凝膠在空氣中放置過久，使膠塊失水、干燥：切膠后應(yīng)立即進(jìn)行回收或保存在4或-20。3)制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。建

18、議：將融膠問題提高到60度；可能是膠的濃度太高，需要提高融膠液的體積；融膠過程中每隔一段時(shí)間就震蕩幾下幫助融膠。7. 如果膠在后續(xù)過程發(fā)生膠沒有徹底融化，如何補(bǔ)救？膠很難融如何處理？答：補(bǔ)加融膠液，將膠懸起來，50-60繼續(xù)保溫至徹底融化。將融膠問題提高到60度；可能是膠的濃度太高，需要提高融膠液的體積；融膠過程中每隔一段時(shí)間就震蕩幾下幫助融膠。8. 沒有回收到 DNA片段？如在洗脫后，發(fā)現(xiàn)洗脫液中沒有DNA片段，請檢查是否按瓶身標(biāo)簽，在洗滌液中加入了無水乙醇。9. 提取率低？（1) 融膠液為酸性緩沖液,如融膠后，其 pH 值升高將影響提取得率.請加入 0.1 倍體積的 3M 乙酸鉀（pH=5

19、.0）。（2) 長時(shí)間使用后沒有更換的電泳緩沖液，其pH值較高，將影響 DNA 的吸附.請更換新的電泳緩沖液后，再進(jìn)行電泳，然后切膠。（3) 在洗脫前，將洗脫液于 3060溫浴，可提高提取效率。10. 如果DNA純化的得率非常低或根本沒有，估計(jì)是什么問題？一點(diǎn)都不能得到產(chǎn)物的回收情況很少見，有些情況是判定回收效率的方式不對(duì)。如對(duì)，請檢查一下Wash中有沒有加入酒精；檢查加入的DNA結(jié)合劑（Solution S或Solution SN）的量對(duì)不對(duì)；洗脫前有沒有將殘留得酒精去徹底；洗脫液有沒有使吸附材料充分接觸（洗脫），接觸的時(shí)間是否充分。11. 用Ez-Resin如果涼干過頭，如何處理？答：加T

20、E，50-60度處理10分鐘，間或振蕩，離心收集上清。12. 如何計(jì)算提取率？1) 由于回收前樣品中，往往含有非目的 DNA 片段，引物，dNTP 等，所以不能用測回收前后吸光度的的方法計(jì)算回收率。2) 可將回收前后 DNA 片段一起電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后，用配套的軟件進(jìn)行電泳條帶灰度對(duì)比.3) 注意，電泳條件及拍攝條件將對(duì)灰度對(duì)比結(jié)果造成很大影響，請仔細(xì)操作，以減小誤差。13. 如何提高膠回收的得率？Agarose抑制DNA與吸附材料的結(jié)合，將不含DNA片段多余的 Agarose切除，能顯著提高回首效率。DNA結(jié)合到吸附材料，需要一定濃度的結(jié)合劑，Agarose多了，結(jié)合劑（Solut

21、ion SN）的相對(duì)濃度就會(huì)下降，得率就受到影響。大多數(shù)情況下，是由于電泳時(shí)瓊脂糖的濃度不同，切下的膠塊有大有小，得率自然不同。回收的得率還與回收片段的大小有關(guān)。提高結(jié)合劑（Solution SN）的相對(duì)濃度，增加 DNA與吸附材料作用時(shí)間（放置時(shí)間），控制好離心速度都一定程度上可以提高得率。改善洗脫條件，如提高洗脫溶液的pH值，溫度，增加洗脫液的體積等也可以提高得率，但是對(duì)于pH過高，可能會(huì)影響下游反應(yīng)，通常情況下采用pH8-8. 為宜。14. 純化過程中乙醇或核酸結(jié)合劑（Solution S, SN, B等）不能去除干凈，對(duì)下游實(shí)驗(yàn)有影響嗎？影響非常大。操作過程中有專門除殘留乙醇的步驟，不

22、可以省略，否則下游的酶切和連接都可能遇到問題?？梢允购怂峤Y(jié)合到吸附材料上的吸附劑很多，這些吸附助劑的殘留對(duì)克隆影響較大。15. 如何鑒定回收的效果？電泳比較回收前后的條帶強(qiáng)弱。比較時(shí)需要將回收的產(chǎn)物全部加到膠中去，具有可比性。如果您的樣品難得，可以選無關(guān)的片段驗(yàn)證一下。16. 洗脫DNA用什么洗脫好？需要根據(jù)您回收片段下游用途確定。一般情況下，采用TE或Tris 緩沖液可以。測序反應(yīng)，請用無菌水洗脫。如果你洗脫的DNA需要長期保存，請用TE洗脫。17. 什么情況下需要在50-60度的情況洗脫?如果您十分關(guān)心效率，回收的片段為大片段（10kb 左右），單鏈片段等需要預(yù)保溫洗脫液。18. UV方式

23、定量回收的量合適嗎？對(duì)于Miniprep,回收的量很少，用UV方式定量不合適，用瓊脂糖電泳方式確定。19. 回收率為什么與點(diǎn)樣量和片段大小有關(guān)？DNA片斷越大，和固相基質(zhì)的結(jié)合力越強(qiáng)，就越難洗脫，回收率就低；DNA的量越少，相對(duì)損失越大，回收率越低。20. 加入溶膠液溫浴后，液體仍很粘稠或后續(xù)步驟有堵柱子現(xiàn)象？1）膠塊溶解不充分，可再補(bǔ)加一些溶膠液或延長水浴時(shí)間并增加上下顛倒次數(shù)幫助溶膠；2）膠塊體積過大，應(yīng)盡量切除多余部分，并將其切為小碎塊，分幾次回收；3）水浴溫度是否達(dá)到規(guī)定溫度65，用溫度計(jì)檢測。21. 能否使用去離子水洗脫回收？可以，但是實(shí)驗(yàn)室所用去離子水一般PH值偏低，可用NaOH適

24、當(dāng)調(diào)高PH值7.0，以增加回收得率。22. 能否使用TE（PH8.0）洗脫？答：可以。23可否使用小于30l的洗脫液進(jìn)行洗脫？答：不可以。因?yàn)檎f明書提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積。24為什么溶膠不徹底會(huì)影響回收結(jié)果的純度？在電泳過程中，DNA會(huì)與大分子的多糖緊密的結(jié)合在一起，凝膠的種類和質(zhì)量不同，DNA與之結(jié)合力也不同，只有凝膠充分溶解，DNA才能充分釋放，否則，凝膠將與DNA一起沉淀下來，洗脫后將影響回收結(jié)果的純度。四、連轉(zhuǎn)1DNA連接失?。ㄒ訲4 DNA連接酶為例）（1）可能是因?yàn)榉磻?yīng)體系內(nèi)無ATP或Mg2+導(dǎo)致連接失敗，解決方案：使用隨酶提供的buffer或向其它兼容的b

25、uffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超過1年，其內(nèi)ATP可能會(huì)降解，導(dǎo)致連接失敗。當(dāng)補(bǔ)加ATP時(shí)，確定補(bǔ)加的是核糖核酸ATP，而不是脫氧核糖核酸ATP，因?yàn)楹笳卟黄鹱饔茫唬?）可能是因?yàn)榉磻?yīng)體系中鹽濃度過高或EDTA含量高導(dǎo)致連接失敗，解決方案：純化DNA； 可能是因?yàn)槿チ姿峄襟E完成后，CIP、BAP或SAP失活不徹底，解決方案：根據(jù)廠家推薦的方法去除去磷酸化酶；（3）可能使因?yàn)檫B接末端為單堿基突出末端，解決方案：使用最高至5l高濃度連接酶16°C過夜連接；（4）可能是因?yàn)椴迦肫魏唾|(zhì)粒沒有磷酸化，假如載體已經(jīng)去磷酸化了，而引物又沒有磷酸化會(huì)導(dǎo)致連接失敗，解決方案：訂

26、購磷酸化的引物或?qū)σ镞M(jìn)行磷酸化；（5）可能是因?yàn)椴迦肫翁?，不能進(jìn)行環(huán)化，解決方案：降低插入片段的濃度，并使用高濃度連接酶16°C過夜連接； 可能是因?yàn)檫B接酶失活，解決方案：用lambda HindIII或其它可行的底物進(jìn)行檢測。2DNA平端連接效率低解決方案：（1） 低溫下長時(shí)間的連接效率比室溫下短時(shí)間連接的好，平端連接需要過夜反應(yīng)；（2）在體系中加一點(diǎn)切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點(diǎn)消失。這樣可避免載體自連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。足夠多的載體和插入片段是最重要的。要看片段具體情況而言，有時(shí)載體和片段濃度過高，容易產(chǎn)生線性化產(chǎn)物，不利于環(huán)化的。插入的DNA片段的摩

27、爾數(shù)是載體摩爾數(shù)的5-10倍，這個(gè)很關(guān)鍵。載體通常50ng就夠了，若載體在10k左右，可用50-100ng；（3） 平端的連接對(duì)于離子濃度很敏感，回收的時(shí)候多洗洗，加PEG和擴(kuò)大酶量，22 2h 后4過夜；（4） 盡可能縮小連接反應(yīng)的體積，最好不超過10µl，在5-6µl 左右最佳；（5）建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14好。五、細(xì)菌培養(yǎng)1.細(xì)菌不生長（1）可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)條件不合適，培養(yǎng)基成分不對(duì)，解決方案：使用適合細(xì)菌生長的優(yōu)化條件，選擇適合細(xì)菌生長的培養(yǎng)基；（2）可能培養(yǎng)基中混入了不對(duì)應(yīng)的抑菌抗生素，解決方案：去除或加入正確的抗生素。2.有雜菌生長（1）可能是操作過

28、程中混入了雜菌，解決方案：注意操作與培養(yǎng)條件，保證無菌，做平行試驗(yàn)檢驗(yàn)；（2）可能是樣品中混入了霉菌，解決方案：空氣中有大量的霉菌，注意樣品的除菌處理；（3）可能是忘記加抗生素，解決方案：加入相應(yīng)的抗生素。六、質(zhì)粒抽提（質(zhì)粒提取常見問題及解決辦法）1使用酚仿抽提方法，質(zhì)粒的純度很好，但酶切不能完全切開？1) 確認(rèn)酶的有效性。2)平衡酚是否被氧化（正常是黃色，而氧化后是棕色的）。3)是否不小心吸入了少量的酚。4)乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（殘留的鹽類會(huì)影響酶切）。5)乙醇漂洗后是否完全干燥（殘留的乙醇會(huì)影響酶切）。2. 提取的質(zhì)粒電泳，為連續(xù)的一片火箭狀？1)如果鹽離子多，會(huì)有走膠變形

29、的現(xiàn)象， 如果提到的質(zhì)粒不夠純，會(huì)有電泳條帶不平齊的現(xiàn)象。2)當(dāng)電壓太大時(shí)，容易出現(xiàn)火箭狀，而降解應(yīng)該是彌散狀。3)可能是宿主菌影響的，質(zhì)粒抽提好后，用酚-氯仿處理一下再酶切。若有改善，則為宿主菌影響。轉(zhuǎn)化到其它宿主菌再切 。4)NaOH的濃度過高，會(huì)出現(xiàn)火箭狀的結(jié)果。3未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，可能存在的原因和解決方法：1)質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。2)菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，

30、檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。3) 菌體過量，堿裂解不充分：取樣時(shí)菌液過多，導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液懸浮液、裂解液、中和液的用量（溶液P1、P2和P3）。一般低拷貝的質(zhì)粒 5ml 的菌液，高拷貝的質(zhì)粒 2-3 ml 小劑量提取。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)，可加倍使用溶液P1、P2和 P3（應(yīng)保持1：1：1.4比例），可能有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。4)溶液使用不當(dāng)：溶液P2、P3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。5)吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB 或2&

31、#215;YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長率，則需調(diào)整LB培養(yǎng)液體積。6)質(zhì)粒未全部溶解（尤其質(zhì)粒較大時(shí)）：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。7)乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。8)洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。9)洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB (10 mM TrisCl, pH 8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH

32、過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水緩沖液加熱至60后使用有利于提高洗脫效率。10)洗脫體積太小：洗脫體積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大，回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。11)洗脫時(shí)間過短：洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置一分鐘可達(dá)到較好的效果。12)堿裂解時(shí)間過長：加入裂解液P2如SDS-NaOH后，時(shí)間不宜超過 5min，因?yàn)榇瞬襟E的目的是使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放，蛋白質(zhì)、染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性，時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致加入中和裂解液P3如酸性醋酸鉀后，仍無法使質(zhì)粒DNA復(fù)性。導(dǎo)致提取失敗。13)大腸桿菌老化：請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)

33、行液體培養(yǎng)。14)細(xì)菌培養(yǎng)物生長過度或不新鮮： 不要于37培養(yǎng)超過16小時(shí)，分離質(zhì)粒前長時(shí)間存放培養(yǎng)物是不利的。15）洗脫效率：洗脫效率與洗脫液PH值、洗脫液用量、洗脫次數(shù)、加入洗脫液后的靜置時(shí)間和是否預(yù)熱等因素有關(guān)。PH7.0-8.5之間，洗脫液用量不得小于50l，重復(fù)洗脫2-3次，增加室溫靜置時(shí)間及65水浴預(yù)熱可以有效提高得率30%。4測序鑒定時(shí)沒有問題的細(xì)菌，37搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常？這種情況常出現(xiàn)在較大質(zhì)粒或比較特殊的序列中。解決辦法：1)降低培養(yǎng)溫度，在2025下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。2)使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使

34、得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。3)質(zhì)粒抽提酶切不完全的可能原因是溶液中的NaOH濃度過高造成的。5試劑盒提取質(zhì)粒純度不高，如何解決？可能存在的原因和解決方法：1)混有蛋白：應(yīng)在加入去蛋白液后，以足夠高的轉(zhuǎn)速離心，使沉淀緊密，并小心地吸取上清液，避免吸入沉淀。另外，不要使用過多菌體。經(jīng)懸浮液、裂解液、中和液處理，離心后溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。2)混有RNA：RNase A處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液P3之后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液P1已保存6個(gè)月以上，請?jiān)谌芤篜1中添加RnaseA 至終濃度100g/ml。3)混有基因組DNA：加入溶液P2和P3后

35、應(yīng)溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液P2后過于粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，不要超過16小時(shí)。4)P3溶液加入時(shí)間過長：P3溶液加入后，放置時(shí)間不要太長，否則有可能會(huì)產(chǎn)生小片段DNA污染。5)含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5和Top10。6)裂解時(shí)間過長：加入溶液P2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過5分鐘。7)質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式：質(zhì)粒復(fù)制過程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測出多條條帶，單酶切處

36、理后可變成單一條帶。6提取的質(zhì)粒在跑膠時(shí)出現(xiàn)了條帶做了酶切后卻看不到任何物質(zhì)？ 可能存在的原因和解決方法：1)質(zhì)粒濃度太低，純度不高（純度對(duì)酶切很重要）。2)出現(xiàn)星號(hào)活性。3)酶切時(shí)間過長，可能質(zhì)粒降解過多：注意酶切體系及加酶量。7提質(zhì)粒大都提的有三條帶，是不是一條帶就是好的呢？ 這兩種情況都可能出現(xiàn)，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但不是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA。其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果不小心在溶液P2加入后過度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-1

37、00 kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。8加完裂解液P2，P3之后動(dòng)作太大有什么影響？ 一般需要掌握好手法，不要給予瞬間的沖量（用手指輕輕彈幾下，以松解難溶的團(tuán)塊也還是允許的），但是也要保證溶液混勻，至于上下顛倒的次數(shù)，依混勻?yàn)闇?zhǔn)。因?yàn)閯?dòng)作大小會(huì)影響DNA的斷裂，不是需要太大的片斷，有些斷裂無所謂，不影響后邊的操作。另外加入溶液P3動(dòng)作過于劇烈，容易導(dǎo)致離心蛋白的效果不佳，也容易導(dǎo)致質(zhì)粒終產(chǎn)物中的菌體基因組DNA污染的增大。9. 在瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣時(shí)，為什么質(zhì)粒漂出點(diǎn)樣孔？乙醇沒有完全從柱子上去除。洗滌液2洗滌后應(yīng)離心并靜置數(shù)分鐘盡量去除殘留乙醇后，再加入洗脫液洗脫回收。10為什么用無水乙醇沉

38、淀DNA？用無水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用95乙醇來替代無水乙醇（因?yàn)闊o水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95乙醇昂貴）。但是加95的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95乙醇代替無水

39、乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530分鐘即可。11在用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.10.25mol/L？在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行

40、洗滌或重沉淀。12為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tr

41、is-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。13抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好？酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約1015的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相

42、混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。14為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊醇？在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊醇為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇

43、有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。15為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？因?yàn)榉优c水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（pH57），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1。8-羥基喹

44、琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮?dú)?，防止與空氣接觸而被氧化。平時(shí)保存在4或20冰箱中，使用時(shí)，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。16. 細(xì)菌離心加入溶液I渦旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀？1）很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來說固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長的要好一些。2）質(zhì)粒抽提過程很大程度上是受細(xì)菌生

45、長情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80保存菌種所培養(yǎng)出來的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會(huì)造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。3）判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果發(fā)現(xiàn)菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發(fā)現(xiàn)呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺很渾濁，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。4） 菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高。達(dá)到OD600 1.5就可以了，（尤其是對(duì)于試劑盒提取要注意）另外如果只是簡單的酶切驗(yàn)證根本無需酚氯仿抽提（安全考慮，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰當(dāng)，轉(zhuǎn)管過程仔細(xì)吸取不會(huì)有太多雜質(zhì)。17. 為什么加了溶液后，菌體沒有逐漸由混濁變澄清？提出

46、來的條帶幾乎沒有，但是RNA很亮（沒加RNA酶）？1）可能是因?yàn)槿芤簝?chǔ)存不當(dāng)，或?qū)掖尾僮鳑]有及時(shí)蓋好溶液瓶蓋，導(dǎo)致其吸收空氣中的CO2失效。RNA在菌體中量較多，相對(duì)少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。 2）可能是菌量大，加溶液后，菌體并不能完全裂解，所以沒有變清，這也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下。3）可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買試劑盒提用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的RNA酶。4）如果不是試劑的原因，可能是質(zhì)粒表達(dá)的過程中使膜蛋白變化（數(shù)量變多），很難使用堿裂解法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高

47、溫或者低溫研磨等)，然后使用一般的發(fā)放。5） 可能質(zhì)粒隨乙醇一起倒掉了。18. 加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態(tài)，或者混濁度沒有明顯的改變？1）問題可能是發(fā)生在溶液II上。首先看看10SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒有沉淀？2）可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液I/II/III的體積。3）可能是“雜菌”污染，如果菌液生長異常快，就有可能被雜菌污染。這種情況一般表現(xiàn)為和目的菌有相同的抗性，生長速度異常，能夠提出質(zhì)粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產(chǎn)物不是自己想要的質(zhì)粒，要特別注意一下。19. 加入酚/仿抽提，離心后在水相和有機(jī)相間沒有出現(xiàn)

48、變性蛋白相層，在隨后的乙醇沉淀步驟中卻出現(xiàn)大量的半透明沉淀，溶解后發(fā)現(xiàn)蛋白濃度很高？ 乙醇沉淀時(shí)，較純的質(zhì)粒沉淀是白色的（PEG純化的沉淀是透明的肉眼不易發(fā)現(xiàn)），如沉淀是半透明的凝膠狀，則應(yīng)是蛋白含量高。首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次檢測溶液III反應(yīng)完成后的離心上清pH是否在8.0左右？有時(shí)由于溶液III配置的問題，會(huì)出現(xiàn)溶液III反應(yīng)后離心的上清pH與8.0偏差較大的現(xiàn)象，這會(huì)降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差過大也會(huì)導(dǎo)致水相和平衡酚互溶。20. 使用酚仿抽提方法，質(zhì)粒的純度很好，但酶切不能完全切開？1）確認(rèn)酶的有效性。2） 平衡酚是否被氧化（正常是黃色，而氧化后是

49、棕色的）。3） 是否不小心吸入了痕量的酚。4） 乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（殘留的鹽類會(huì)影響酶切）。5） 乙醇漂洗后是否完全干燥（殘留的乙醇會(huì)影響酶切）。21. 提取質(zhì)粒中RNA沒有去除？可能是RNase失效或效率不高。1） 更換RNase A，并保證其儲(chǔ)存條件是正確的2） 手工提取質(zhì)粒的，可單獨(dú)增加一步去除RNA的步驟 ，溶液III反應(yīng)后，在離心的上清中加RNase，室溫下去除RNA 10min30min（需要保證RNase A是經(jīng)過失活DNase的），同時(shí)較高溫度（如50）會(huì)更加快速完全的去除RNA，經(jīng)驗(yàn)所得經(jīng)過高溫處理的質(zhì)粒質(zhì)量不是很高。22. 用堿裂解法提取質(zhì)粒，裂解5分鐘，

50、沒有用酚 / 氯仿抽提，最后用滅菌水溶解質(zhì)粒DNA 15min。雙酶切后跑膠一條帶都沒有，原因是什么？1）溶解時(shí)間稍微短了點(diǎn)，但是根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室RNase不同，這個(gè)條件是不同的。在溶解的過程要渦旋處理促進(jìn)溶解。2）確認(rèn)一下酶切過程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切體系的Buffer或者是水，特別是水中；其次是酶切體系的問題；建議再把提取的產(chǎn)物用70%酒精重新洗滌一遍，也可以用酚/氯仿重新抽提一下。3） 也可能在用乙醇洗時(shí)把質(zhì)粒倒掉了。4） 沒有用RNase消化，不要用放久的 RNase否則會(huì)有DNA酶的污染；5）在沒有進(jìn)行酶切時(shí)，把所提的質(zhì)粒跑一下核酸電泳看看，如果是提核酸的問題那這一步電泳結(jié)果應(yīng)該沒有大于三千的條帶，這樣可以先排除核酸提取的問題。若是沒有酶切時(shí)間過長等其他問題的話可以那可以檢查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的問題，建議將超純水換成TE。23. 培養(yǎng)基、抗生素、質(zhì)粒提取都沒有問題，而細(xì)菌菌液提取不到質(zhì)粒？如果是氨芐抗性的