血小板功能檢測的研究進展

1、血小板功能檢測的研究進展         【摘要】  血小板在執(zhí)行生理性止血的同時，也在病理性血栓形成過程中起重要作用。血小板功能檢測對于臨床相關疾病的診斷和抗血小板藥物的篩選及相關研究有著重要的意義。目前，血小板功能檢測的實驗與方法日益增多，但所有這些檢測方法均有不足之處，因而有必要研究和發(fā)展一種操作簡便、檢測靈敏度高的方法。本文對近年來血小板功能檢測方法諸如血小板的一般功能檢測、血小板黏附功能測定、血小板聚集功能測定、血小板釋放功能測定、血小板凝血活性檢測和流式細胞術在血小板功能檢測中的應用等研究進展

2、進行了綜述，并對研究前景作了簡單的展望。 【關鍵詞】  血小板功能檢測   Research Advance in  Platelet Function Assays Review   Abstract   Platelets play a key role in the pathogenesis of atherothrombosis, and also perform  the  physiological hemostasis.The platelet function assays ha

3、ve values in the investigating patients with suspected platelet disorders and in studying the effects of antiplatelet drugs.There are increasing assays for investigating platelet function,including assessment of platelet adhesion,activation and aggregation,etc.However,all of these assays have certai

4、n limited sensitivity.It is necessary to develop a simple, sensitive assay that measures the activated platelet. This article reviewed  advances of researches on platelet function assays, including assay for general function of platelet, assay of platelet adhesion function, plantelet activation

5、 assay, platelet aggregation assay, platelet coagulation assay and application of flow cytometry in assessment of platelet functions, etc.  and looked forward to research prospect in this field.   Key words   platelet； platelet function; platelet function assay   J

6、 Exp Hematol 2007; 15(5):1130-1134   血小板在生理性止血、維持血管壁完整性以及某些病理過程,如血栓形成、動脈粥樣硬化、不穩(wěn)定性心絞痛、腫瘤轉移和炎癥反應等過程中起著重要作用1,2。因此，血小板功能檢測對早期發(fā)現(xiàn)是否有血栓形成的危險以及血小板相關疾病的診斷和治療有著重要的意義。本文就血小板功能檢測方法的研究進展作如下綜述。   血小板功能檢測可分為血小板一般功能測定，血小板黏附、聚集及釋放功能的測定和流式細胞術（FCM）分析等。   血小板一般功能測定   這種測定包括出血時間的測

7、定3、血塊收縮試驗、活化凝血時間測定、快速血小板功能分析法（RPFA）4等，是目前臨床評價血小板功能的輔助手段。   血小板粘附功能測定   1941年Wright5建立了轉動玻瓶法測定抗凝全血中的血小板在玻璃瓶表面的黏附特性。1960年，Hellem6建立了玻璃珠柱法測定枸櫞酸抗凝全血或富血小板血漿的血小板粘附性。血液通過玻璃珠柱后，由于血小板粘附在玻珠或塑料管，以及形成的血小板聚集體被滯留在玻璃珠柱內(nèi)。因此，過柱后血液中的血小板數(shù)降低，故又稱滯留試驗。1963年Salzman7對Hellem法加以改進，血液抽出后為經(jīng)抗凝直接通過玻璃珠柱進行測定，本法

8、有助于粘附性減低的出血患者的診斷，但對粘附性增高的血栓性疾病敏感性降低。   血小板聚集功能的測定   血小板聚集是血小板的一個重要生理特性，是其參與止血和血栓形成過程的重要因素之一。血小板聚集功能的測定對于臨床上診斷血栓前狀態(tài)和血栓性疾病具有重要意義。長期以來血小板聚集活性的檢測一直是血小板體外功能評價的金標準8。目前已有多種方法對血小板聚集活性進行定量或定性的測定。   肉眼或鏡下檢查法   主要觀察聚集顆粒出現(xiàn)的時間及其大小，以判斷血小板的聚集活性，但是只能粗略地評價血小板的聚集活性。  

9、 將全血以恒定的速度通過微孔金屬網(wǎng)，若血小板聚集成團，則阻止血流通過，測定過濾前后的壓力差來表示血小板聚集活性。   PRP比濁法   最初由Bron9提出，在特定的攪拌條件下，在富含血小板血漿（PRP）中加入誘導劑，血小板激活后GP ba復合物暴露出纖維蛋白原的受體并與其結合而導致血小板聚集，血漿濁度降低，透光率增加，光電池迅速將光濁度的信號轉換為電訊號，在記錄儀上記錄下電訊號的變化。   PRP比濁法是目前應用最廣泛的一種測定法，臨床上對于血小板無力癥、原發(fā)性血小板增多癥及血栓前狀態(tài)和血栓性疾病的診斷具有重要意義。這種方法也存在不

10、足之處：需要去除紅細胞，可導致CO2的揮發(fā)和pH增高，不能完全反映體內(nèi)血細胞之間的相互作用；測定時間過長可導致血小板活性降低；對血小板聚集物的形成不敏感，只能檢測大的血小板聚集物；離心過程也會導致血小板的激活和紅細胞碎片中血小板的丟失；血小板數(shù)目的調(diào)整難以標準化；重現(xiàn)性差10；而且高脂血癥的PRP會影響吸光度，減少PRP與PPP之間的差異。因此，體外血小板聚集實驗不能準確反應體內(nèi)血小板的聚集功能和血小板活化水平的變化11。   全血電阻抗法   1980年Cardina和Flower12以電阻抗原理設計了一種測定全血中血小板聚集的方法，即在測定管中加入2

11、個電極，加入誘導劑膠原或ADP，血小板發(fā)生聚集而堆積在電極上，阻抗就相應增加，在記錄儀上記錄這種阻抗，以觀察體外血小板的聚集活性。這種方法的優(yōu)點是直接使用全血，無需富血小板血漿的制備，操作更簡便快捷；無需經(jīng)過離心，是新型血小板功能試驗和血小板拮抗劑評價的良好供選方案13；對于脂血標本的測定，可以克服比濁法因渾濁而影響結果。這種方法的不足之處，與比濁法相比較對小聚集物的形成不敏感，且每次測定后需要清洗電極，連接電極的電線需要小心放置，不能彎曲，使其很難滿足臨床工作的需要。   全血血小板計數(shù)法   用來測定血小板聚集時減少血小板數(shù)目。將枸櫞酸鈉抗凝的全血放

12、到含有旋轉離心磁棒的聚苯乙烯試管中，并在37下孵育，用甲醛固定單個血小板，以測定起始血小板數(shù)。加入誘聚劑誘導血小板聚集，并測定聚集后血小板數(shù)量，聚集前后進行比較，得出血小板減少的百分率。該法對很小的血小板聚集物敏感，并不需要對抗凝全血的稀釋，耗血量少，所需時間短，可用于評價血小板功能異常的病人。   血小板功能分析儀（PFA100）   PFA100系統(tǒng)最早在1995年由Kundu等14提出，對抗凝全血的血小板功能進行定量檢測。PFA100模仿體內(nèi)血管損傷時的止血環(huán)境，此系統(tǒng)由微處理器控制，使用一次性反應杯，內(nèi)有一層生物膜，表面附有膠原，并含有ADP或腎

13、上腺素。當用枸櫞酸鈉抗凝的全血從膜的小孔中抽吸出來時，血小板粘附于膠原并被ADP或腎上腺素進一步活化，形成血小板栓子，將小孔阻塞，儀器自動記錄小孔完全阻塞的時間，所需的時間稱為"封閉時間"。膠原和ADP用來區(qū)分先天和后天性血小板功能障礙，膠原和腎上腺素都適合檢測阿斯匹林誘導的正常人血小板異常15。PFA100操作簡單，結果準確，臨床上用于VWD和血小板異常的篩選，以及抗血小板藥物治療的監(jiān)測和外科手術過程中初級止血的評價。然而PFA100對于纖維蛋白原缺陷疾病的診斷的靈敏度低16。   體外血小板聚集計測定法   在高剪切力條件下測定血

14、小板的黏附和聚集。該方法簡單快捷，僅需要0.2ml血液17。臨床用來抗血小板藥物的治療、血栓前狀態(tài)及血小板功能亢進等疾病18和心胸外科出血的監(jiān)測19。   剪切誘導血小板聚集測定法   該方法采用旋轉式鐵板流體測定儀，將PRP注入平板的內(nèi)筒內(nèi)，氦氖激光透過其中，通過圓錐的旋轉產(chǎn)生剪切力，從而引起血小板聚集，血小板聚集引起PRP透光度的變化，由電腦進行分析處理，最后繪制成聚集曲線20。剪切誘導的血小板聚集對于血栓性血小板疾病，如腦血栓、動脈粥樣硬化的防治具有重要意義。但是溫度和血小板數(shù)目對該法的測定結果都有較大的影響。   散射性粒子檢

15、測法   該方法最先由Ozaki21提出，儀器采用HeNe半導激光器（波長為675 nm）通過聚光鏡折射成直徑約為40 m的激光束，照射到裝有富血小板血漿（PRP）比色杯。該方法能通過血小板聚集顆粒的大小及其生成數(shù)量兩個指標來評價血小板的聚集功能，血小板聚集顆粒的大小及數(shù)量與散射強度相一致，與比濁法相比，靈敏度有了很大提高。   微量板滴定法   即應用全自動定量繪圖酶標儀根據(jù)比色法測定血小板聚集率。與比濁法相比較，微量板滴定法更靈敏、有效且重現(xiàn)性好，可用于檢測已知血小板功能拮抗劑，如吲哚美辛、阿斯匹林等，且可以檢測未知血小板調(diào)節(jié)因子

16、8。該方法的最大優(yōu)點是可以一次測定多個樣品，尤適用于臨床和科研中對批量血小板聚集率的測定。但是要求血小板計數(shù)在一定范圍內(nèi)的結果才比較準確。            血小板釋放功能的測定   血小板胞漿內(nèi)含有顆粒、致密顆粒及溶酶體顆粒，當加入誘聚劑后會引起這些顆粒內(nèi)容物的釋放，即血小板的釋放。顆粒的釋放主要通過血小板球蛋白（TG）和血小板4因子（PF4）來測定。用商品化的放射性免疫法和ELISA法試劑盒對其進行定量測定已被推廣使用，其結果對樣品的處理過程高度敏感，但是結果易受機體

17、代謝功能和血小板破壞的影響。研究發(fā)現(xiàn)P選擇素即血小板顆粒膜蛋白140（GMP140），表達在靜息血小板膜上。當血小板活化后，P選擇素在血小板膜表面表達，并同時釋放顆粒的內(nèi)容物，P選擇素可作為血小板活化的分子標志物22。在血栓性血小板減少性紫癜（TTP）、子癇等血栓性疾病及糖尿病病人的P選擇素增加23，24。因此，檢測P選擇素陽性血小板數(shù)量是活化血小板最為客觀、直接、特異的檢測方法。致密顆粒的釋放可以通過5羥色胺（5HT）或腺苷酸的測定加以判斷。5HT測定應用熒光光度法測定，與同樣處理的標準物比較，求得血小板或血漿中5HT含量，用于篩選血小板貯存池缺陷導致膠原誘導的血小板致密顆粒釋放障礙、先天性

18、或后天性TXA2合成障礙、ADP受體缺陷等疾病。應用熒光聚集儀可同時測定血小板聚集和ATP的釋放反應。   血小板其他功能檢測   血小板其他功能的檢測包括血小板凝血活性檢測、血小板鈣流檢測以及血小板膜糖蛋白的檢測等。血小板第3因子利用試驗用于檢測血小板凝血活性，使用正常人和病人富含血小板血漿(PRP)和乏血小板血漿(PPP)相互交叉配合,以白陶土作活化劑促使PF3形成來測定血漿凝固時間,通過比較各組時差,從而得出PF3是否有缺陷，臨床上用于診斷先天性PF3缺乏癥、血小板無力癥、骨髓增生異常綜合征等。   大部分血小板內(nèi)游離的Ca2+

19、貯存在致密管道系統(tǒng)內(nèi)，血小板活化后，Ca2+從致密管道系統(tǒng)釋放至胞質(zhì)內(nèi)，細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平增加。利用熒光探針標記血小板內(nèi)鈣離子，在誘導劑作用下，血小板的鈣離子通道打開，使用共聚焦顯微鏡觀察血小板熒光的強弱變化并經(jīng)計算機控制系統(tǒng)及圖像分析系統(tǒng)觀察血小板濃度和鈣流的變化。測定胞內(nèi)Ca2+的方法可用于臨床診斷與Ca2+代謝有關的血小板疾病。   血小板膜含有多種糖蛋白，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）可以將血小板溶液中的糖蛋白按分子量大小進行分離。血小板膜GPIb和GPIIbIIIa復合物的測定用于巨大血小板綜合癥和血小板無力癥的診斷。   流式細胞

20、術在血小板功能檢測中應用   隨著流式細胞術的成熟以及各種熒光標記的單克隆抗體的研制成功并可以直接標記熒光素分子，為血小板活化機制研究開辟了新的局面。   傳統(tǒng)的流式細胞術   即使用洗滌的血小板或PRP檢測血小板膜糖蛋白的表達。樣本在離心、洗滌等操作過程中極易活化，導致血小板體外激活，影響臨床診斷價值。   全血法流式細胞術   主要是對血小板特異性膜糖蛋白和活化標志物進行免疫熒光標記，用流式細胞儀測定熒光強度和特異性熒光抗體結合陽性的血小板百分率，來測定血循環(huán)中血小板的活化狀態(tài)以及血小板對激

21、活劑的應答反應。與常規(guī)血小板功能測定法相比，全血法流式細胞術有許多優(yōu)點：直接應用全血，反映了血小板生理狀態(tài)下的功能，同時簡化了標本的處理，最大限度的減少了人為活化血小板；避免了因離心導致的血小板體外激活，并防止血小板亞群的丟失；標本用量少，尤其適用于兒童和血小板減少癥的患者；亦能檢測出少到1%的活化的血小板亞群，能分析單個或亞群血小板膜活化標志物的測定。此外，血小板活化時其細胞內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生很大變化25，借助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監(jiān)測的非免疫性指標。然而，Ca2+流變化極為迅速，使得FCM定量測定較為困難。但是全血法流式細胞術也存在不足之處，

22、如流式細胞儀價格昂貴，儀器操作復雜；同時為了避免血小板體外活化，血樣需在45分鐘內(nèi)處理，不能長久放置；只能分析循環(huán)中的血小板的數(shù)量和功能，不能反映血小板代謝和最近被清除的血小板的數(shù)量。而且，血小板膜糖蛋白種類多，與血小板的功能狀態(tài)都有關系，目前還沒有一個單抗或幾個單抗的組合可以全面客觀評價血小板功能，該方法還需進行更深入的研究使之標準化。   展   望   綜上所述，近年來血小板功能檢測的方法有了較大的發(fā)展，為臨床血栓與止血研究和出血與血栓性疾病的診治提供了更為廣闊的前景。然而，目前的血小板功能檢側方法仍然存在不足，建立并完善一種操

23、作簡便，準確快捷的血小板功能評價的新方法仍是研究的熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)血小板膜纖維蛋白原受體（b3）活化即構象的改變與血小板的活化有關，b3的活化和暴露是血小板聚集的前提條件，CD42a（GPIX）在靜息或活化的血小板上都表達，是血小板的標志物。Nyland13指出，與其他已經(jīng)確定的檢測方法相比較，纖維蛋白原受體激活測定法是血小板功能評價的良好方法。另外，血小板的膜磷脂（磷酯酰絲氨酸PS、磷酯酰肌醇PI）在膜表面的側相分布與血小板的功能狀態(tài)有關，靜息血小板的PS和PI分布在膜的內(nèi)側，活化的血小板PS和PI在膜發(fā)生側相翻轉，即由膜內(nèi)側翻向膜外側。目前，我們實驗室已初步檢測并分析了CD41a、CD4

24、2b和CD62p等陽性百分率與血小板聚集活性的關系，PS側相分布的變化與血小板功能狀態(tài)的關系，血小板胞漿內(nèi)顆粒釋放與血小板質(zhì)量的關系，并用抗CD42a的單抗將血小板與其它血細胞區(qū)分，再用PAC1檢測b3的暴露情況，擬建立FAR法來判斷血小板的功能，以期建立一種更科學，更準確的血小板功能評價方法?！緟⒖嘉墨I】  1Steinhubl SR, Moliterno DJ. The role of the platelet in the pathogenesis of atherothrombosis. Am J Cardiovasc Drugs, 2005; 5:399-4082Weyrich AS, Zimmerman GA. Platelets: signaling cells in the immune continuum.Trends Immunol, 2004; 9:489-4953Thiagarajan P,Wu KK. In vitro assays for evaluating platelet function. In:Gresele P,Page CP,Fuster V,et al,editors.Platelets in Thrombotic and NonThrombotic Disorders.Cambridge:Cambridge Un