圖解olige6.0

1、引物設(shè)計(jì)軟件oligo應(yīng)用簡(jiǎn)介2008年03月04日 星期二 上午 10:11在專門的引物設(shè)計(jì)軟件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0的初始界面是兩個(gè)圖：Tm圖和G圖；Oligo 6.0的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個(gè)圖，加了個(gè)Frq圖?！癘ligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。oligo的下載和安裝我就不多說(shuō)了，打開oligo相信也無(wú)需多講。打開oligo的頁(yè)面如下： 單擊file菜單再點(diǎn)open或點(diǎn)擊“打開”快捷圖標(biāo)或者用快捷鍵“CTrlO”可打開下面的窗口 在打開的

2、OPEN窗口內(nèi)選擇FreqSeq再點(diǎn)“打開” 選擇drosfr或者其它一個(gè)文件點(diǎn)擊“打開” 出現(xiàn)以下窗口，點(diǎn)擊“window”再點(diǎn)擊“Tile” 出現(xiàn)以下窗口，圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為Tm、G和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，為鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo 5.0，只是顯示更清楚了。 G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的G值在5端和中間值比

3、較高，而在3端相對(duì)低（如圖：）Tm值曲線以選取72附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線為“Oligo 6”新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3端Frq值相對(duì)較低的片段。 再點(diǎn)擊Search再點(diǎn)“Fo'r Primers and probes”或使用快捷鍵F3 出現(xiàn)以下窗口，點(diǎn)OK就OK了。當(dāng)然你也可以點(diǎn)擊“Prameters”和“Search Range”選擇你要的參數(shù)和你上下游引物的位置及你擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。 出現(xiàn)Search Status窗口，點(diǎn)“OK” 出現(xiàn)Primer pairs窗口，代表引物對(duì)的編號(hào)，依次為引物對(duì)所處

4、的位置、產(chǎn)物的長(zhǎng)度、最適合的退火溫度、和GC的百分含量 點(diǎn)擊任一行出現(xiàn)“PCR”窗口，告知你擴(kuò)增片斷的位置，最合適的退火溫度等等信息。 關(guān)掉“PCR窗口”和“primer Pairs窗口”回到原來(lái)的窗口你就能看到你引物的序列和位置，圖中手型鼠標(biāo)所指即為引物序列。 至此引物設(shè)計(jì)已經(jīng)完成，你可以用“Analyse”菜單分析你的引物：有無(wú)引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等等。 當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)并根據(jù)評(píng)價(jià)對(duì)引物進(jìn)行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測(cè)（非克?。┬訮CR，對(duì)引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來(lái)說(shuō)，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過(guò)4.5為好。當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低。這種PCR需要通過(guò)靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不