2022年細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

1、培養(yǎng)基的配置：根底培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml凍存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。依次比例酌量配置。超凈工作臺(tái)常規(guī)配置移液器1套2.5l、20l、200l、1ml，酒精燈1盞，液器1臺(tái)，斜架1臺(tái)，酒精噴壺1個(gè)，酒精棉球缸1個(gè)，污缸1個(gè)，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶502，定量移液管5ml、10ml，槍頭1ml、200l、10l，培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，保種管所需試劑：gibco高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：所需的各項(xiàng)高壓后的耗材放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用酒精噴壺噴灑實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，并關(guān)閉工作臺(tái)翻開紫外燈照射30min后

2、開場實(shí)驗(yàn)操作。首次傳代前細(xì)胞的復(fù)蘇，首先用一大燒杯盛滿37的溫水放于液氮罐旁邊，待細(xì)胞株取出后留上端1/3于37水面上盡最大速搖動(dòng)管使其在2min內(nèi)迅速融化。假設(shè)種管頂部含有凍存的細(xì)胞液在搖動(dòng)期間用力甩動(dòng)使其降于管底后再搖動(dòng)。這一過程可在超凈工作臺(tái)外操作。實(shí)驗(yàn)步驟一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)1. 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2. 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放

3、在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。3. 取1個(gè)高壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次分別放于酒精燈兩側(cè)，把保種管在超凈臺(tái)外用酒精棉球擦拭下2/3后拿進(jìn)超凈臺(tái)內(nèi)在酒精燈上消毒保種管口2-3次放于臺(tái)面左手邊，取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取保種管內(nèi)的細(xì)胞液，懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)。4. 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶內(nèi)吸取4ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放，在瓶身

4、做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。5. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。6. 將培養(yǎng)瓶放于28,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。注意整個(gè)培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h，瓶蓋擰緊后拿出培養(yǎng)箱，置于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，及細(xì)胞形態(tài)。最后更換培養(yǎng)液。二、 培養(yǎng)液的更換1 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋

5、開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，瓶蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，4 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶內(nèi)吸取4ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放。5 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)

6、面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。6. 將培養(yǎng)瓶放于28,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長情況，一般72-96h后，細(xì)胞生長密度大于90%，即可進(jìn)展細(xì)胞的傳代。三、 細(xì)胞傳代1. 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。3. 將培養(yǎng)

7、瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，瓶蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)。4. 將培養(yǎng)瓶平放使胰酶浸沒整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)約40s，立馬豎起對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，這時(shí)為胰酶消化的最適時(shí)機(jī)。假設(shè)看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；假設(shè)看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，那么需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細(xì)胞層1s后迅速豎起對(duì)著燈光觀察細(xì)胞情況，可反復(fù)幾次，直至出現(xiàn)

8、針孔樣縫隙和1-2個(gè)細(xì)胞脫落的最正確消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。5. 吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶內(nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。6. 取2或3個(gè)高壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次分別放于酒精燈兩側(cè)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基均勻的分到3或4個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)注意原來傳代時(shí)使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用，進(jìn)展1傳3或1傳4的培養(yǎng)。7. 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培

9、養(yǎng)基瓶內(nèi)吸取4ml培養(yǎng)基懸空移入每個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放，在瓶身做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。8. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。9. 將培養(yǎng)瓶放于28,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。注意整個(gè)培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長情況，一般72-96h后，細(xì)胞生長密度大于90%，即可進(jìn)展細(xì)胞的傳代或保株。四、 細(xì)胞株的保存1. 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作

10、臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)。4. 將培養(yǎng)使胰酶浸沒整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)約40s，立馬豎起對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之

11、間有針孔樣縫隙，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，這時(shí)為胰酶消化的最適時(shí)機(jī)。假設(shè)看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；假設(shè)看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，那么需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細(xì)胞層1s后迅速豎起對(duì)著燈光觀察細(xì)胞情況，可反復(fù)幾次，直至出現(xiàn)針孔樣縫隙和1-2個(gè)細(xì)胞脫落的最正確消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。5. 吸取1ml細(xì)胞凍存液于培養(yǎng)瓶內(nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。6. 將1ml含有細(xì)胞的凍存液移入新的保種管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。7. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰

12、緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。8. 將保種管先放于4冰箱 30min后拿出放置-20冰箱過夜，次日再放于-80的冰箱內(nèi)3-4天，最后存放于-196的液氮灌內(nèi)長期保存。注此過程也可簡化因?qū)嶋H操作過程中經(jīng)歷所得：步驟7完畢后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80冰箱內(nèi)4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80冰箱也可保存細(xì)胞株2-3月。五、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作前：紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。1. 預(yù)混液A fugeneHD 5ul/孔 + OPTI-MEM 45ul/孔 室溫溫育10min2. 預(yù)混液B arr

13、 16ul/孔 + OPTI-MEM 34ul/孔 室溫溫育5min3. 預(yù)混液C 空載 16ul/孔 + OPTI-MEM 34ul/孔 室溫溫育5min4. 預(yù)混液D arr 12ul/孔 + ops 12ul/孔 + OPTI-MEM 26ul/孔室溫溫育5min注：fugeneHD為轉(zhuǎn)染試劑 ，arr，空載，ops為模板？OPTI-MEM為空培養(yǎng)基5. 將步驟2,3,4中的預(yù)混液B,C,D中分別參加步驟1中的等體積的預(yù)混液A，輕柔混勻，室溫溫育15min，再次輕柔混勻后室溫溫育15min。6. 取出6孔培養(yǎng)板，將每培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基全部吸凈，無殘留，是為了防止殘留的雙抗和胎牛血清影響轉(zhuǎn)染效果。參加1.5-2.0ml/孔的OPTI-MEM 到6孔培養(yǎng)板內(nèi)，輕輕搖勻。7. 將步驟5中再次混勻溫育完畢的預(yù)混液B,C,D,分別以100ul/孔， 參加目的培養(yǎng)孔中空載，目的質(zhì)粒，48h 72h，按上下，左右，斜對(duì)角的方向輕輕搖勻。8. 28，5%CO2培養(yǎng)箱孵育6