細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)講義

1、細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)講義細(xì)胞遺傳學(xué)課程組編寫山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2021. 9第一局部遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一果蠅的性別鑒定、性狀觀察及飼養(yǎng)方法 1實(shí)驗(yàn)二果蠅的雙因子雜交實(shí)驗(yàn)7.實(shí)驗(yàn)三果蠅的伴性遺傳8.實(shí)驗(yàn)四果蠅的三點(diǎn)測交1.0實(shí)驗(yàn)五果蠅唾腺染色體的制備和觀察 12實(shí)驗(yàn)六植物有絲分裂過程中染色體行為的觀察 1 5實(shí)驗(yàn)七植物減數(shù)分裂過程中染色體行為的觀察 1 7實(shí)驗(yàn)八去壁低滲法制備植物染色體標(biāo)本 20實(shí)驗(yàn)九植物染色體核型分析 22第二局部細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一特殊光學(xué)顯微鏡的原理和使用26實(shí)驗(yàn)二電子顯微鏡的原理和使用 31實(shí)驗(yàn)三Feulgen反響35實(shí)驗(yàn)四細(xì)胞融合37實(shí)驗(yàn)五細(xì)胞膜的通透性40實(shí)驗(yàn)六植物凝集素

2、對紅細(xì)胞的凝集作用 40實(shí)驗(yàn)七葉綠體的別離和熒光觀察 42實(shí)驗(yàn)八植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察 45第一局部遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一果蠅的性別鑒定、性狀觀察及飼養(yǎng)方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握果蠅的根本特征及鑒別雌、雄果蠅的方法，熟悉常見突變型;2了解果蠅生活周期的特征及各階段的形態(tài)變化；3. 掌握果蠅的飼養(yǎng)、麻醉等實(shí)驗(yàn)處理的方法和技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理果蠅屬于昆蟲綱、雙翅目、果蠅科、果蠅屬。成蟲具有一對興旺的膜質(zhì)前翅，后翅特化為一對平衡棒。果蠅作為遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)材料具有很多突出的優(yōu)點(diǎn)：1 容易飼養(yǎng)，生活周期短在25°C下約910天就能完成一個(gè)世代；2繁殖 能力強(qiáng)，每只受精的雌蟲約可產(chǎn)卵 400600粒，因此在短時(shí)

3、間內(nèi)可獲得較大的 子代群體，有利于遺傳學(xué)分析；3突變類型多，研究得較清楚的突變已達(dá)400 多個(gè)，且多數(shù)是形態(tài)特征的變異，便于觀察；4染色體數(shù)目少，2n = 8，唾腺 染色體較大。因此果蠅在遺傳學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。三實(shí)驗(yàn)材料、器具和試劑1. 實(shí)驗(yàn)材料野生型果蠅常見的突變型果蠅黑檀體、殘翅、白眼及三隱性突變體：白眼小翅焦剛毛。2. 器具體視顯微鏡、毛筆、麻醉瓶、白紙板、尸體盛留器內(nèi)裝 70%的乙醇或自來 水。培養(yǎng)果蠅所需設(shè)備：生化培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋或溫度可達(dá)160C左右的烘箱、培養(yǎng)瓶、天平。3. 藥品或試劑乙醚裝在滴瓶中配制果蠅培養(yǎng)基的藥品：玉米粉、蔗糖食用白砂糖即可、酵母粉市售 酵母粉即可

4、、丙酸、瓊脂、水蒸餾水或自來水均可。四實(shí)驗(yàn)步驟一生活周期的觀察果蠅是完全變態(tài)昆蟲，生活周期可分為 4個(gè)時(shí)期：卵、幼蟲、蛹和成蟲。果 蠅生活周期的長短與培養(yǎng)溫度直接相關(guān)，最適培養(yǎng)溫度為2025 C,溫度越高，生長越快，但高于30C引起果蠅不育甚至死亡，低溫那么使其生活周期延長。20E 時(shí)，果蠅卵到成蟲約需15天，25E時(shí)，從卵到成蟲約需10天，在25E時(shí)成蟲 約活15天。圖1果蠅的生活周期25r下，成蠅一般在交配一、兩天后開始產(chǎn)卵。果蠅四個(gè)生長時(shí)期的特點(diǎn)如 下：卵：白色，橢圓形，長約0.5mm，前端反面有一對觸絲能使卵附著在食物上。 受精卵在24小時(shí)內(nèi)就可孵化成幼蟲。幼蟲：從卵孵化出來后，經(jīng)過兩

5、次蛻皮，發(fā)育成三齡幼蟲。此時(shí)幼蟲體長4-5m m,幼蟲頭尖尾鈍，頭上有一黑色鉤狀口器。幼蟲活動(dòng)力強(qiáng)而貪食，它們在 培養(yǎng)基上爬行時(shí)，留下很多條溝，溝多而且寬時(shí)，說明幼蟲生長良好。幼蟲生活 4天左右開始化蛹。蛹：化蛹前三齡幼蟲停止攝食，爬到相對枯燥的外表上如培養(yǎng)瓶壁，逐 漸形成菱形的蛹，起初蛹?xì)ゎ伾S而柔軟，以后逐漸硬化，變?yōu)樯詈稚?，說明 即將羽化了。成蟲：剛從蛹?xì)だ镉鸹鰜淼墓壪x體比擬長，翅膀尚未展開，體表尚未完 全幾丁質(zhì)化，故呈半透明的乳白色。透過腹部體壁，可以看到黑色的消化系統(tǒng)。不久，變?yōu)槎檀謭A形，雙翅展開，體色加深。從蛹?xì)ぶ杏鸹鰜淼墓?812 小時(shí)即可交配，交配后精子可在雌蠅的受精

6、囊中貯存一段時(shí)間， 然后逐漸釋放到 輸卵管中。未交配的雌果蠅稱為處女蠅。果蠅雜交實(shí)驗(yàn)必須選用處女蠅，因此選擇處女蠅的時(shí)間是在羽化后12小時(shí)以內(nèi)為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠，以選擇羽化后 8小時(shí)以內(nèi)的雌蠅為好。收集處女 蠅的方法是：選擇一個(gè)果蠅生長良好、含有較多即將羽化的蛹的培養(yǎng)瓶，去除其 中所有成蠅。去除成蠅后的12小時(shí)8小時(shí)更為可靠內(nèi)，從該瓶中收集到的 雌蠅即為處女蠅，反復(fù)收集直到數(shù)量足夠應(yīng)用為止。處女蠅單獨(dú)存放在一個(gè)新的 培養(yǎng)瓶中，最好在距雜交實(shí)驗(yàn)前一星期左右開始收集處女蠅， 這樣能將收集到的 處女蠅存放幾天以檢驗(yàn) 處女性如培養(yǎng)35天后瓶中出現(xiàn)幼蟲那么說明收集失 敗，得重新收集。不同時(shí)間收集的處女蠅

7、最好分開存放。二果蠅的形態(tài)特征和常見的突變類型1 雌雄果蠅的鑒別雌雄果蠅的主要區(qū)別見表1和圖2,圖3,圖4。表1雌雄果蠅的主要區(qū)別$大小大小形態(tài)腹部末端稍尖腹部末端呈鈍圓形顏色腹部末端色淺，腹部反面呈5條黑色 條紋腹部末端黑色，腹背3條條紋，最 后一條極寬，并延伸到腹面，呈一 明顯黑斑性梳無第一對胸足的跗節(jié)基部有性梳腹部6個(gè)腹片4個(gè)腹片性梳：果蠅只有雄體在第一對胸足的跗節(jié)基部有一黑色鬃毛結(jié)構(gòu)，形似一小梳， 稱為性梳。而雌體沒有性梳。性梳的有無是鑒別雌雄蠅的可靠標(biāo)志之一， 需要在 顯微鏡下才易觀察。圖2雌雄果蠅反面觀圖3雄果蠅胸足上的性梳圖4雌雄果蠅腹部結(jié)構(gòu)左雌右雄，雄蠅外生殖器的構(gòu)造比雌蠅復(fù)雜

8、，顏色很深，雌蠅那么很淺，這是區(qū)分雌雄的一個(gè)特征。在果蠅的翅與第三對附肢之間有一對平衡棒，用于調(diào)整姿勢保持平衡。2 常見突變性狀的觀察野生型果蠅為灰體、長翅翅的長度約為腹部長度的兩倍、紅眼、直剛毛頭胸部以及復(fù)眼的周圍具有平直，先端略彎的長型粗黑硬毛常見的突變體見表2三果蠅麻醉方法選擇親本果蠅進(jìn)行雜交或觀察果蠅性狀時(shí)， 都先要將果蠅麻醉，使之處于不 活動(dòng)狀態(tài)。麻醉果蠅的操作步驟如下：1 準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶、麻醉瓶及乙醚。輕拍瓶壁，讓果蠅震落到培養(yǎng)基上。如瓶塞 上附著果蠅，那么稍稍晃動(dòng)瓶塞，并將它們拍落在培養(yǎng)基上。表2果蠅常見的突變類型突變名稱基因符號(hào)形狀特征所在染色體白眼w復(fù)眼白色X黑檀體e體呈烏木色

9、，黑亮IIIR黑體b體呈深黑色I(xiàn)IL殘翅vg翅退化，局部殘留不能飛IIR小翅m翅較短，僅至腹端X焦剛毛sn3剛毛卷曲如燒焦?fàn)頧2. 拔去麻醉瓶塞與培養(yǎng)瓶塞，迅速將培養(yǎng)瓶口倒扣在麻醉瓶口上。輕拍培養(yǎng)瓶 讓果蠅落入麻醉瓶中(如果培養(yǎng)基已很稀松，那么切勿倒扣，應(yīng)將兩瓶口橫著對接， 小心地將果蠅驅(qū)入麻醉瓶)。當(dāng)麻醉瓶中的果蠅數(shù)量足夠時(shí)， 將兩瓶迅速分開各 自蓋好。3. 把麻醉瓶中的果蠅拍落到瓶底，迅速拔出塞子，滴上幾滴乙醚，重新塞上麻 醉瓶。麻醉一段時(shí)間后，果蠅不再活動(dòng)，紛紛落入瓶底，麻醉完成。此時(shí)果蠅的翅膀是收緊的。長時(shí)間麻醉可使果蠅死亡，麻醉而死的果蠅翅膀外展，與身體成 45 °角。4.

10、 將麻醉的果蠅傾倒在一張干凈的白紙板上，置于體視顯微鏡下用毛筆或解剖 針輕輕撥動(dòng)觀察。如在觀察過程中果蠅蘇醒過來，可用一培養(yǎng)皿罩住果蠅，再在 一濾紙條上滴一滴乙醚伸入培養(yǎng)皿中，形成一個(gè)臨時(shí)麻醉小室再行麻醉。(四) 果蠅的培養(yǎng)1. 培養(yǎng)基的制備(1) 培養(yǎng)瓶的滅菌 果蠅的培養(yǎng)基要裝在經(jīng)過滅菌處理的培養(yǎng)瓶中。 滅菌可以防 止真菌污染，也可以殺死培養(yǎng)瓶中可能殘留的幼蟲或蛹，防止混雜。滅菌的方法 是：將帶塞的培養(yǎng)瓶在160°C恒溫箱中干熱滅菌1小時(shí)，或在高壓蒸汽滅菌鍋中， 在1kg/cm2大氣壓、121C條件下滅菌1520mi n。(2) 培養(yǎng)基的配制 酵母菌是果蠅幼蟲和成蟲的主要食物， 但

11、凡能發(fā)酵的物質(zhì)都可以成為它們的培養(yǎng)基。果蠅培養(yǎng)基的配制方法很多，表3列出其中一種。表3果蠅培養(yǎng)基成分配方水玉米粉蔗糖瓊脂丙酸酵母粉1L105g75g7.5g6.25ml20g培養(yǎng)基配制過程如下：量取1L水，將大約一半倒入一干凈的容器中，參加 瓊脂加熱溶解，水開后，參加蔗糖，攪拌均勻；將玉米粉參加另一半水中，攪拌 均勻，再沿著容器邊慢慢倒入，邊倒邊攪拌這樣玉米粉不易結(jié)塊。繼續(xù)煮 10多分鐘，培養(yǎng)基成為一種糊狀物時(shí)即可關(guān)火。參加丙酸用以防腐及酵母 粉，攪拌均勻即可分裝。每瓶培養(yǎng)基厚約 2cm，室溫下枯燥23天，待培養(yǎng)基 完全凝固，外表堅(jiān)硬時(shí)再行接種，培養(yǎng)基太軟會(huì)粘住果蠅致其死亡。2 果蠅培養(yǎng)溫度對

12、果蠅的生長發(fā)育影響很大，25°C是最適生長溫度；1020°C環(huán)境中生 活周期延長；低于10C那么可能影響生活力。因此可以利用此特征調(diào)節(jié)果蠅生長 的速度，控制其群體的大小。比方：原種培養(yǎng)旨在保種，可將培養(yǎng)瓶置于1819C下培養(yǎng)；雜交實(shí)驗(yàn)需要較大的群體，那么可將培養(yǎng)溫度設(shè)為25C。培養(yǎng)時(shí)避免日光直射。五考前須知1. 麻醉果蠅時(shí)要掌握麻醉尺度，需要用活體時(shí)，注意不能麻醉過度使果蠅致死。2 把麻醉的果蠅移入一個(gè)新的培養(yǎng)瓶時(shí)，注意先將培養(yǎng)瓶橫臥，用毛筆將果蠅 輕輕挑入，待果蠅蘇醒后再將培養(yǎng)瓶直立起來，以防果蠅被新配制的略帶粘稠的 培養(yǎng)基粘住導(dǎo)致死亡。3實(shí)驗(yàn)后不用的果蠅要倒入尸體盛留器

13、中，不可放飛。六思考題1 如何鑒別果蠅的雌雄？2. 什么是處女蠅，如何收集處女蠅？3記錄實(shí)驗(yàn)中觀察到的野生型果蠅及其常見突變體的性狀。實(shí)驗(yàn)二 果蠅的雙因子雜交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 通過兩對性狀個(gè)體雜交，了解兩對非等位基因間的自由組合現(xiàn)象、驗(yàn)證自 由組合規(guī)律。2. 掌握果蠅的雜交技術(shù)，學(xué)會(huì)記錄交配結(jié)果和掌握統(tǒng)計(jì)處理方法。實(shí)驗(yàn)原理果蠅的灰體基因E與黑檀體基因e為一對相對性狀，位于川R70.7位 置，而長翅Vg與殘翅vg為另一對相對性狀，位于U R67.0位置。這兩對 基因是沒有連鎖關(guān)系的，位于不同染色體上的非等位基因。根據(jù)非等位基因別離的自由組合定律，在F1代產(chǎn)生配子時(shí)，非等位基因的別離是獨(dú)立的，它們

14、彼此自由組合，產(chǎn)生四種基因型的配子EVg，Evg，eVg，evg，且它們的比例相同。這四種配子自由結(jié)合，因此在 F2代會(huì)出現(xiàn)9種基因 型的后代，假設(shè)顯性完全，就出現(xiàn) 4種表型，比例為9: 3: 3: 1。正交：灰體殘翅早H黑檀體長翅廠 PEEvgvg eeVgVg灰體長翅F1EeVgvgJ自交F2三實(shí)驗(yàn)材料1 器具顯微鏡、體視顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、麻醉瓶、毛筆2藥品乙醚、果蠅培 養(yǎng)基3材料灰體長翅果蠅 EEVgVg、黑檀體殘翅果蠅 eevgvg四實(shí)驗(yàn)步驟1 選處女蠅：每組做正交1瓶，正交選灰體殘翅為母本，黑檀體長翅為父本， 將母本舊瓶中的果蠅全部麻醉處死，在 8-12h內(nèi)收集處女蠅5只，

15、將處女蠅和5 只黑檀體雄蠅轉(zhuǎn)移到新的雜交瓶中，貼好標(biāo)簽，于 25 C培養(yǎng)；2. 7d后，釋放雜交親本；3. 再過4-5天，F(xiàn)1成蠅出現(xiàn)，在處死親本7天后，集中觀察記錄F1表型；4 .選取5對F1代果蠅，轉(zhuǎn)入一新培養(yǎng)瓶，于25 E培養(yǎng)，其余F1代果蠅處死；5. 7d后，處死F1親本；6. 再過5d，F(xiàn)2成蠅出現(xiàn)，開始觀察記錄，連續(xù)統(tǒng)計(jì) 7d。五考前須知1. 保證雜交所用的親本雌果蠅一定是處女蠅；2. 雜交后倒掉親本時(shí)，一定要倒干凈，以免造成回交產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)誤差。同樣在F1自交后，倒掉F1時(shí)一定要倒干凈，以免造成 F1和F2的混雜產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)誤差3. 所有培養(yǎng)瓶的標(biāo)簽都應(yīng)注明雜交組合、時(shí)間及培養(yǎng)人組別、姓

16、名。六實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察1 .設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)記錄表以隨時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2. 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)論。3. 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表及統(tǒng)計(jì)分析過程均寫入實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)三果蠅的伴性遺傳實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解伴性遺傳并認(rèn)識(shí)果蠅伴性遺傳的特點(diǎn)。2正確認(rèn)識(shí)伴性遺傳與非伴性遺傳的區(qū)別以及伴性基因在正反交中的差異實(shí)驗(yàn)原理位于性染色體上的基因的遺傳方式與位于常染色體上的基因有一定差異，它在親代與子代之間的傳遞方式與雌雄性別有關(guān)，這種遺傳方式稱為伴性遺傳。伴性基因主要位于X染色體上，Y染色體上沒有相應(yīng)的等位基因。決定紅眼、白眼的基因位于X染色體上，是-對等位基因。正父：野生型早突變型含反交：突變型早野生型含紅眼紅眼紅眼白眼雌：野生

17、型雌：1/2野生型，1/2突變型雄：1/2野生型，1/2突變型雄：1/2野生型，1/2突變型非伴性基因的F1代均表現(xiàn)顯性性狀，而伴性基因，在正交情況下，F(xiàn)1代和非伴性遺傳相同，而在反交情況下，F(xiàn)1代會(huì)出現(xiàn)隱性性狀。交叉遺傳：X染色體的遺傳過程中，子代雄性個(gè)體的X染色體均來自母本， 而父本的X染色體總傳遞給子代雌性個(gè)體。三實(shí)驗(yàn)材料1 器具顯微鏡、體視顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、麻醉瓶、毛筆2藥品乙醚、果蠅培 養(yǎng)基3材料野生型果蠅紅眼+、突變型果蠅白眼 ww四實(shí)驗(yàn)步驟1. 選處女蠅：每兩組做正、反交各1瓶，正交選野生型紅眼為母本，突變型白眼為父本，將母本舊瓶中的果蠅全部麻醉處死，在8-12h內(nèi)收集

18、處女蠅5只，將處女蠅和5只雄蠅轉(zhuǎn)移到新的雜交瓶中，貼好標(biāo)簽，于 25°C培養(yǎng)；2. 7d后，釋放雜交親本一定要干凈；3. 再過4-5天，F(xiàn)1成蠅出現(xiàn)，在處死親本7天后，集中觀察記錄F1表型；4. 選取5對F1代果蠅，轉(zhuǎn)入一新培養(yǎng)瓶，于 25 C培養(yǎng)，其余F1代果蠅處死；5. 7d后，處死F1親本；6. 再過5d，F(xiàn)2成蠅出現(xiàn)，開始觀察記錄，連續(xù)統(tǒng)計(jì) 7d。五考前須知1. F1雜交時(shí)不需要選擇處女蠅2雜交時(shí)先將麻醉的果蠅放在培養(yǎng)瓶壁上并將培養(yǎng)瓶橫放，果蠅蘇醒后再把培 養(yǎng)瓶豎起，防止培養(yǎng)基粘住麻醉后的果蠅。六實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察1 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)記錄表以隨時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得出

19、結(jié)論。3 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表及統(tǒng)計(jì)分析過程均寫入實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)四果蠅的三點(diǎn)測交實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握三點(diǎn)測交的原理及方法；2. 學(xué)習(xí)三點(diǎn)測交的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理及分析方法;3了解繪制遺傳學(xué)圖的原理和方法。實(shí)驗(yàn)原理連鎖交換定律：處在同一染色體上的兩個(gè)或兩個(gè)以上基因遺傳時(shí)， 聯(lián)合在一 起的頻率大于重新組合的頻率。重組類型的產(chǎn)生是由于配子形成過程中， 同源染 色體的非姊妹染色單體間發(fā)生了局部交換的結(jié)果。三點(diǎn)測交：三點(diǎn)測交就是通過一次雜交和一次測交，同時(shí)確定三對等位基因即三個(gè)基因位點(diǎn)的排列順序和它們之間的遺傳距離，是基因定位的常用方法。 主要過程是：用三雜合體和三隱性個(gè)體雜交，獲得三因子雜種F1，再使F1與三隱性基因

20、純合體測交，通過對測交后代表現(xiàn)型及其數(shù)目的分析， 分別計(jì)算三 個(gè)連鎖基因之間的交換值，從而確定這三個(gè)基因在同一染色體上的順序和距離。 通過一次三點(diǎn)測驗(yàn)可以同時(shí)確定三個(gè)連鎖基因的位置， 即相當(dāng)于進(jìn)行三次兩點(diǎn)測 驗(yàn)，而且能在試驗(yàn)中檢測到所發(fā)生的雙交換。如果兩個(gè)基因間的單交換并不影響鄰近兩個(gè)基因的單交換，那么預(yù)期的雙交換頻率應(yīng)當(dāng)?shù)扔趦蓚€(gè)單交換頻率的乘積，但實(shí)際上觀察到的雙頰還值往往低于預(yù)期值，因?yàn)槊恳淮伟l(fā)生單交換，它鄰近也發(fā)生一次交換的時(shí)機(jī)就減少，這叫干預(yù)般用并發(fā)率表示干預(yù)的大小 三實(shí)驗(yàn)材料1 器具顯微鏡、體視顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、麻醉瓶、毛筆2藥品乙醚、果蠅培 養(yǎng)基3材料黑腹果蠅品系：野生型

21、果蠅紅眼、長翅、直剛毛 +三隱性突變體果蠅白眼、小翅、焦剛毛 wms n四實(shí)驗(yàn)步驟1. 選處女蠅：每組做正，反交各1瓶，正交選野生型為母本，三隱性雄蠅為父 本。反交選三隱性雌蠅為母本，野生型為父本，將母本舊瓶中的果蠅全部麻醉處 死，在8-12h內(nèi)收集處女蠅5只，將處女蠅和5只雄蠅轉(zhuǎn)移到新的雜交瓶中，貼 好標(biāo)簽，于25C培養(yǎng)；2. 7d后，釋放雜交親本一定要干凈；3. 再過4-5天，F(xiàn)1成蠅出現(xiàn)，在處死親本7天后，集中觀察記錄F1表型及性 別。4. 選取5對F1代果蠅，轉(zhuǎn)入一新培養(yǎng)瓶，于 25 E培養(yǎng)，其余F1代果蠅處死;5. 7d后，處死F1親本；6. 再過5d，F(xiàn)2成蠅出現(xiàn)，開始觀察記錄，連

22、續(xù)統(tǒng)計(jì) 7d,觀察眼色，翅形及剛毛形態(tài)。正交只需統(tǒng)計(jì)雄性個(gè)體。要求每組至少統(tǒng)計(jì)250只果蠅。五考前須知1. 長翅果蠅在成蟲未發(fā)育完全時(shí)翅較小此時(shí)體色較淺，注意與小翅果蠅區(qū) 別。2. 觀察剛毛可以在體視顯微鏡或顯微鏡的低倍鏡下。六實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察1. 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)記錄表以隨時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果2 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪出連鎖圖3 為什么正交只需統(tǒng)計(jì)雄性個(gè)體？實(shí)驗(yàn)五果蠅唾腺染色體的制備和觀祭一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握果蠅三齡幼蟲唾腺的別離技術(shù)，學(xué)習(xí)唾腺染色體的制片方法。2. 觀察了解果蠅唾腺染色體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。二實(shí)驗(yàn)原理果蠅是雙翅目昆蟲，其唾腺細(xì)胞發(fā)育到一定階段后停止在間期，但緊密配對的同源染色體，仍能不斷復(fù)制，復(fù)

23、制后產(chǎn)生的子染色體彼此不分開。復(fù)制可達(dá)9次之多，因此一對染色體最終可產(chǎn)生 2&9= 1024條染色質(zhì)絲。它們集結(jié)在一起 形成了一條多線染色體，寬度可達(dá) 5m，長度可達(dá)400m，約為普通中期染色 體的100150倍，因而又稱為巨大染色體，在顯微鏡下清晰可見。唾腺染色體形成時(shí)，染色體的著絲粒和近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)聚在一起形成 一種結(jié)構(gòu)，稱為染色中心chromocente。黑腹果蠅D.melanogate唾腺染 色體組成為2n=8,其中1號(hào)染色體X染色體是端著絲粒染色體，著絲粒的 一端附在染色中心，另一端游離；2號(hào)和3號(hào)染色體是中部著絲粒染色體，每條 染色體呈“V字形向外伸展出兩條臂，形成2

24、L、2R、3L、3R四條臂L代表left arm,左臂；R代表right arm，右臂。4號(hào)染色體短小，呈點(diǎn)狀附在染色中心 邊緣。所以在光學(xué)顯微鏡下可見巨大染色體從染色中心向四周放射狀地伸出5長1短共6條臂圖5。雌雄果蠅唾腺染色體的差異在于，雄果蠅的 Y染色體 幾乎包含在染色中心里，因?yàn)槭钱惾旧|(zhì)，染色較淡。雄果蠅的X染色體比雌果蠅的X染色體細(xì)一些，因?yàn)樾坌灾挥幸粭l X染色體。由于唾腺細(xì)胞在果蠅幼蟲時(shí)期一直處于分裂間期， 每條染色質(zhì)絲都處于伸展 狀態(tài)，因而不同于有絲分裂中期高度螺旋化的染色體。 這些染色質(zhì)絲的不同部位 螺旋化程度不同，其中螺旋化程度較高的部位形成染色粒。 這些染色粒經(jīng)由多線 染

25、色體的放大，形成染色較深的橫紋band，而染色粒間螺旋化程度較低的部 分那么形成了染色較淺的間紋in terba nd。研究說明，對一種果蠅來說，帶紋的 寬窄、數(shù)目、位置等是恒定的，標(biāo)志著物種的特征。當(dāng)染色體上有結(jié)構(gòu)畸變，如缺失、重復(fù)、倒位、易位等，很容易在唾腺染色體上鑒別，使唾腺染色體成為研究染色體變異的獨(dú)特材料X2L圖5 D.melanogater的巨大唾腺染色體的形態(tài)以及各條臂末端的形態(tài)及橫紋特征 圖中的箭頭指向X染色體上蓬突，這是 X染色體的特征性的結(jié)構(gòu)，星號(hào)指該染色體上深染 的橫紋，小圓圈代表沒有或帶紋不明顯。這些特征是識(shí)別各條臂的主要參考依據(jù)。三實(shí)驗(yàn)材料、器具和試劑1 實(shí)驗(yàn)材料黑腹

26、果蠅三齡幼蟲2器具顯微鏡、雙筒體視顯微鏡、解剖針、鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙等3 藥品及試劑生理鹽水0.7% NaCl溶液、卡寶品紅染液、1mol/L HCl、蒸餾水四實(shí)驗(yàn)步驟1. 三齡幼蟲的培養(yǎng)將35對果蠅放入加有酵母菌的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行幼蟲培養(yǎng)，注意親本不可投放 過多，以控制幼蟲的密度。培養(yǎng)基可適當(dāng)降低濃度，以利于幼蟲活動(dòng)取食。當(dāng)培 養(yǎng)瓶中出現(xiàn)幼蟲后可適當(dāng)追加酵母液2%4%的酵母水溶液，每天滴加1 2滴，三齡幼蟲期那么滴加10%的酵母液。同時(shí)，在1518C的低溫條件下培養(yǎng) 以延長果蠅的生活史周期，使幼蟲充分生長。實(shí)驗(yàn)時(shí)選用行動(dòng)緩慢、肥大、爬在 瓶壁上即將化蛹的三齡幼蟲。2 剝離唾腺：在一干凈

27、的載玻片上滴一滴生理鹽水，將果蠅三齡幼蟲置于載玻 片上。每只手各持一個(gè)解剖針，在解剖鏡下進(jìn)行操作。果蠅的唾腺位于幼蟲體前 約1/3處，找到具有口器的頭部有一小黑點(diǎn)，一手用解剖針刺入或壓住 頭部，將蟲固定，一手用解剖針刺入體前約 1/3處，適當(dāng)用力向兩端迅速拉開。 唾腺是一對透明的棒狀腺體，外有白色的脂肪組織不透明。去除幼蟲其它組 織局部，并把唾腺周圍的白色脂肪剝離干凈。圖6果蠅唾腺的別離操作示意圖3. 染色：用濾紙條吸去多余的生理鹽水，在剝凈的唾腺上滴一滴1mol/L HCI解 離2 -3分鐘，使組織疏松，以便壓片時(shí)細(xì)胞分散，染色體散開。解離完畢用濾紙條吸去鹽酸，滴加1滴蒸餾水輕輕沖洗后吸干，

28、滴加適量的卡寶品紅染液，染 色 5 10min。4. 壓片：將載玻片放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，蓋上蓋玻片，用火柴棍或鉛筆的橡皮頭螺旋 形由中間向四周，輕輕敲擊蓋玻片，使細(xì)胞分散，染色體平展；再用濾紙覆蓋在 蓋玻片上，用兩個(gè)拇指垂直用力按壓。5. 鏡檢：先在低倍鏡下選擇唾腺細(xì)胞多且染色體分散好的視野，再換用高倍鏡 仔細(xì)觀察唾腺染色體的染色中心、染色體臂、橫紋、蓬突 puff 等結(jié)構(gòu)。五考前須知1. 在載玻片上滴加的生理鹽水不要過多，否那么幼蟲會(huì)漂浮而且活潑。2. 剝離唾腺后用濾紙條吸去多余的生理鹽水，吸水時(shí)動(dòng)作要慢，防止連同唾腺 一起吸走。3. 染色時(shí)應(yīng)保持腺體一直處于染液的浸泡中，以防腺體枯燥。4. 壓片

29、時(shí)用力要均勻，注意不要使蓋片滑動(dòng)，否那么會(huì)造成染色體的扭曲斷裂六實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察1 繪出你所觀察到的果蠅唾腺染色體，標(biāo)明染色中心和6條臂2 果蠅唾腺染色體具有哪些特點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)六 植物有絲分裂過程中染色體行為的觀察一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)根尖有絲分裂制片的技術(shù)。2. 觀察有絲分裂各時(shí)期染色體的形態(tài)變化，識(shí)別有絲分裂的不同時(shí)期。二實(shí)驗(yàn)原理有絲分裂也叫體細(xì)胞分裂。高等生物個(gè)體的生長發(fā)育是通過細(xì)胞的有絲分裂 增殖而形成的。有絲分裂中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都發(fā)生很大變化，但最明顯的是核， 特別是核內(nèi)的染色體。根據(jù)細(xì)胞核分裂變化的特征，有絲分裂過程可分為間期、 前期、中期、后期、末期五個(gè)時(shí)期。兩次細(xì)胞分裂之間的時(shí)期稱為間

30、期。有絲分 裂的結(jié)果是產(chǎn)生了兩個(gè)相同的子細(xì)胞，每個(gè)子細(xì)胞精確地含有和親代細(xì)胞一樣數(shù) 目的染色體，從而使遺傳物質(zhì)在物種內(nèi)及親子代間保持穩(wěn)定。用于有絲分裂制片的組織一般是處于活潑分裂狀態(tài)的動(dòng)植物組織，如動(dòng)物的 紅骨髓、外周血細(xì)胞，植物的根尖、莖尖以及通過組織培養(yǎng)得到的愈傷組織等。 制片方法多采用壓片法，就是將經(jīng)過處理的動(dòng)植物材料放在載玻片與蓋玻片之 間，施加一定的壓力使材料分散開來。此方法大體包括取材、預(yù)處理、固定、解 離、染色和壓片幾個(gè)步驟。三實(shí)驗(yàn)材料1 材料大蒜根尖(染色體數(shù)2n=16)2 試劑0.05%秋水仙素或0.002mol/L 8-羥基喹啉、卡諾固定液、解離液(1mol/L HCI)、

31、 卡寶品紅、95%酒精、70%酒精卡諾固定液的配制：3份無水酒精參加1份冰醋酸現(xiàn)用現(xiàn)配?？▽毱芳t即石碳酸品紅，配制方法為：配方I 石碳酸品紅Carbolfuchsin,先配母液 A和B。母液A :稱取3克堿性品紅，溶解于100毫升的70%酒精中此液可長期 保存。母液B:取母液A 10毫升，參加90毫升的5%石碳酸水溶液2周內(nèi)使用。石碳酸品紅染色液：取母液 B 45毫升，參加6毫升冰醋酸和6毫升37%的 甲醛。此染色液含有較多的甲醛，在植物原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中，觀察核分裂比擬 適宜，后來在此根底上，加以改進(jìn)的配方U,稱改進(jìn)石碳酸品紅，可以普遍應(yīng)用 于植物染色體的壓片技術(shù)。配方U:改進(jìn)石碳酸品紅取配

32、方I石碳酸品紅染色液 210毫升，參加9098毫升45%的醋酸和1.8 克山梨醇sorbitol。此染色液初配好時(shí)顏色較淺，放置兩周后，染色能力顯著 增強(qiáng)，在室溫下不產(chǎn)生沉淀而較穩(wěn)定。3器具顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、吸水紙、燒杯、火柴棍四實(shí)驗(yàn)步驟1 取材：將大蒜瓣掰開，大頭朝下置于白瓷盤中，加上少許水，34天后根長到1cm左右，將根剪下，用蒸餾水洗幾次。2. 預(yù)處理：根尖用0.05%的秋水仙素溶液或0.002mol/L 8-羥基喹啉水溶液處理 4h左右。目的是抑制紡錘絲的形成，收集更多中期分裂相，同時(shí)使染色體縮短，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)更加分散。3. 固定：預(yù)處理過的根尖用蒸餾水洗幾次，在卡諾固定液中

33、固定224h，之后 用95%酒精沖洗，再轉(zhuǎn)入70%酒精中，可于4C冰箱保存。固定的目的是迅速 殺死活細(xì)胞，同時(shí)使染色體的蛋白變性，保持其固有的形態(tài)。4. 解離：固定后的根尖用蒸餾水沖洗，參加解離液1mol/L HCl 于60C解離 10分鐘。之后用自來水換洗3次，每次5分鐘，將解離液徹底洗凈。解離的目 的是將細(xì)胞分散開來，使組織軟化，易于壓片。5. 染色和壓片：取一解離好的根尖置于載玻片間，切去根冠，從分生組織酸解后根尖頂端一小段乳白色組織中切取盡可能薄的一片，加一滴卡寶品紅染液， 染色510分鐘，加上蓋玻片，取吸水紙覆于蓋玻片左側(cè)，左手食指中指按在此 處，右手持一火柴棍對準(zhǔn)根尖切片敲擊， 再

34、用鉛筆的橡皮頭將材料均勻敲散。在蓋片上覆兩張濾紙，以兩個(gè)拇指垂直按壓制片。6鏡檢：用低倍鏡找到分裂期細(xì)胞，再轉(zhuǎn)用高倍鏡仔細(xì)觀察。五考前須知1. 切取分生組織時(shí)要使切片盡可能薄，不要將后面分生區(qū)的細(xì)胞一同切下來, 影響分裂相細(xì)胞的尋找。2 壓片材料要少，防止細(xì)胞緊貼在一起，致使細(xì)胞和染色體沒有伸展的余地'3. 按壓制片時(shí)注意不要移動(dòng)蓋片。六實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察1. 要求找到有絲分裂的各個(gè)時(shí)期的典型圖像。2. 繪制觀察到的有絲分裂各個(gè)時(shí)期的 分裂相并描述其特征。實(shí)驗(yàn)七 植物減數(shù)分裂過程中染色體行為的觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握制備植物細(xì)胞減數(shù)分裂玻片標(biāo)本的技術(shù)和方法。2. 觀察植物花粉形成中減數(shù)分裂各個(gè)

35、時(shí)期的特征及染色體變化 二實(shí)驗(yàn)原理減數(shù)分裂是進(jìn)行有性生殖的動(dòng)植物性母細(xì)胞成熟、形成配子過程中的一種特 殊的細(xì)胞分裂方式。在減數(shù)分裂過程中，染色體復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次， 第一次分裂后染色體數(shù)目減半，第二次分裂過程中每條染色體的兩條染色單體分 開，最終形成的配子中染色體數(shù)目僅為性母細(xì)胞的一半。受精時(shí)雌雄配子結(jié)合， 恢復(fù)親代染色體數(shù)目，從而保持物種染色體數(shù)目的恒定。植物形成配子時(shí)，由花藥或胚珠中的某些細(xì)胞分化為二倍性的小抱子母細(xì)胞 或大抱子母細(xì)胞，這些細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行兩次細(xì)胞分裂即減數(shù)第一分裂和減數(shù)第二分 裂，結(jié)果一個(gè)小抱子母細(xì)胞形成 4個(gè)小抱子，一個(gè)大抱子母細(xì)胞形成一個(gè)大抱子， 它們都只具有單倍

36、的染色體。植物材料的減數(shù)分裂制片通常采用涂片法，制片過 程包括：取材、固定、染色及壓片幾個(gè)步驟。為更好地識(shí)別減數(shù)分裂的各個(gè)時(shí)期，現(xiàn)把減數(shù)分裂各時(shí)期的主要特點(diǎn)表達(dá)如 下:1間期：細(xì)胞染色質(zhì)松散，核內(nèi)染色較為均勻。2減數(shù)第一次分裂1前期I:持續(xù)時(shí)間較長，染色體變化較為復(fù)雜，可分為 5個(gè)時(shí)期。 細(xì)線期：染色體呈現(xiàn)細(xì)絲狀，繞成一團(tuán)，核仁明顯。偶線期：同源染色體開始聯(lián)會(huì)配對。粗線期：染色體逐漸縮短變粗。每條染色體已經(jīng)復(fù)制，著絲粒未分開，稱為 二價(jià)體。雙線期：染色體更為縮短。配對的同源染色體開始互相排斥而分開， 此時(shí)可 以看到染色體的交叉現(xiàn)象。濃縮期終變期：染色體更為粗短，呈 V，0, 8和X形狀，均勻分

37、散， 利于計(jì)數(shù)。2中期I :核膜、核仁消失，紡錘體形成，染色體排列在赤道板上，每對染色體 的著絲粒分別處在赤道板的兩側(cè)。3后期I:同源染色體分開，移向兩極。由于著絲粒未分開，細(xì)胞兩極的染色體 數(shù)是性母細(xì)胞的一半，每條染色體中依然含有兩條染色單體。4末期I :移動(dòng)到兩極的染色體解旋恢復(fù)到染色質(zhì)狀態(tài)。核膜、核仁重新出現(xiàn)，細(xì)胞板形成，1個(gè)性母細(xì)胞分裂為2個(gè)子細(xì)胞。每個(gè)子細(xì)胞中含有單倍的染色體。3減數(shù)第二次分裂1前期II:與有絲分裂前期一樣，每條染色體都具有兩條染色單體。不同的是， 前期II的細(xì)胞僅有半數(shù)的染色體n，而有絲分裂前期，染色體數(shù)為2n。2中期II :染色體濃縮變短，著絲粒排列在赤道板上，紡

38、錘體出現(xiàn)。3后期II :姐妹染色體別離并移向兩極。4末期II :移動(dòng)到兩極的染色體解旋恢復(fù)到染色質(zhì)狀態(tài)，核膜、核仁出現(xiàn)。細(xì) 胞板形成，每個(gè)細(xì)胞分為2個(gè)子細(xì)胞。經(jīng)過這樣的減數(shù)分裂，一個(gè)性母細(xì)胞分裂形成4個(gè)子細(xì)胞，即四分抱子，四 分抱子在花粉囊中進(jìn)一步發(fā)育成為花粉粒。圖7提供了玉米花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的過程，供大家參考。三實(shí)驗(yàn)材料1 .材料：大蔥花蕾染色體數(shù) 2n=162器材和儀器：顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、濾紙3. 試劑：卡諾氏固定液、70%酒精、卡寶品紅染色液(tto Anaphusy II(m Tslophaso Hio) Thio tetrad屮)Young pcN&n grai

39、ns圖7玉米花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程四實(shí)驗(yàn)步驟1. 取材固定：選取處于減數(shù)分裂期的大蔥花蕾，通常于上午 79時(shí)摘取大蔥花 蕾莖頂幼小花序，放入內(nèi)裝有卡諾氏固定液的廣口瓶中， 固定324小時(shí)，轉(zhuǎn)入 70%酒精中置4C冰箱內(nèi)保存。2 制片：用鑷子小心撥開花藥壁，擠出花粉粒，涂于載玻片上，用鑷子輕輕搗 碎，用卡寶品紅染色35分鐘，蓋上蓋玻片。再把片子放在濾紙下，用拇指適 力壓下，使材料分開，并把周圍的染色液吸干。3鏡檢：先在低倍鏡下找到分裂相細(xì)胞，再轉(zhuǎn)用高倍鏡仔細(xì)觀察。五考前須知1 取材的時(shí)間及材料大小必須十分恰當(dāng)，才能獲得更多的花粉母細(xì)胞分裂相以 供觀察。2. 不同部位花粉粒的成熟程度不同，取材時(shí)可

40、以選擇不同部位的材料，以便觀 察到更多的分裂相。六實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察 觀察減數(shù)分裂各時(shí)期染色體的特點(diǎn)并畫圖表示。實(shí)驗(yàn)八去壁低滲法制備植物染色體標(biāo)本一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解植物細(xì)胞周期中染色體的周期變化。2. 學(xué)習(xí)去壁低滲火焰枯燥法進(jìn)行植物染色體制片的根本原理和方法。二實(shí)驗(yàn)原理植物染色體的常規(guī)壓片技術(shù)在植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用，特別是許多植物的染色體計(jì)數(shù)和組型分析都是用這種方法完成，但這種方法也存在一 定缺陷，如染色體很難完全散開，容易產(chǎn)生重疊、變形、斷裂，影響顯帶結(jié)果等， 給核型分析增加了不少困難。另外，在當(dāng)前植物染色體Giemsa分帶研究中，出于壓片法很難完全除掉細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞壁對染色體的覆蓋

41、，因而常常造成Giemsa帶可重復(fù)性較低，使植物染色體 Giemsa分帶研究受到一定的影響。其次，由于 植物染色體處理方法尚不理想，影響到亞顯微結(jié)構(gòu)的研究。因此改革植物染色體 壓片法是促進(jìn)植物染色體的研究，特別是植物染色體Giemsa分帶和亞顯微結(jié)構(gòu)研究的關(guān)鍵。20世紀(jì)70年代以來一些從事植物染色體研究的學(xué)者，參照動(dòng)物 及人類染色體標(biāo)本制備技術(shù)，開展了對植物細(xì)胞去壁、低滲、火焰枯燥方法的研 究，取得了很好的結(jié)果。目前這種方法已廣泛用于染色體計(jì)數(shù)、 組型分析、顯帶、 顯微操作、原位雜交等分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究領(lǐng)域。三實(shí)驗(yàn)材料1 器具恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、載玻片、酒精燈。2藥品對二氯苯飽和溶液、甲醇、冰

42、醋酸、70%乙醇、纖維素酶、果膠酶、Giemsa 原液、1/15mol/L 磷酸緩沖液pH 值 6.8 7.2、0.075mol/L KCI.3材料水稻Oryza sativa、玉米Zea mayS、蠶豆Vicia faba、豌豆Pisum sativum 種子或洋蔥Allium cepa鱗莖。四實(shí)驗(yàn)步驟1. 取材：先將種子浸泡假設(shè)干小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入一墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，放在25C恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待根長至12cm取材；或鱗莖置于盛水的燒杯中，放 在25C恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待根尖長至 2cm左右取根尖頂端0.51cm。2. 預(yù)處理：將取下的根尖置于盛有在有 0.001%0.02%秋水仙堿或0

43、.002mol/L 8- 羥基喹啉或?qū)Χ缺斤柡退芤旱那嗝顾匦∑恐薪萏幚怼?. 前低滲：將根尖放在 0.075mol/L KCI溶液中處理30 min。4. 酶解去壁：倒去KCl溶液，用蒸餾水充分洗凈。參加混合酶液纖維素酶與果 膠酶各占2.5%，25E30C下酶解23h 或37C水浴酶解45min。在酶解 過程中最好輕輕搖動(dòng)瓶子，促使酶解反響更加充分。5. 后低滲：倒去酶液，用蒸餾水慢慢沖洗23次，然后在蒸餾水中停留1040min進(jìn)行后低滲處理。使細(xì)胞充分膨脹，細(xì)胞內(nèi)的染色體充分分散開，對以后 的染色體觀察有利。6. 制備細(xì)胞懸液：低滲完畢，用滴管將水抽干凈，只剩下材料，此時(shí)的根尖非常柔軟

44、易散，用鑷子充分搗碎材料，加上新配制的固定液，固定液的多少以使分 散的細(xì)胞充別離開材料懸在固定液中為準(zhǔn)，用鑷子攪拌，靜止片刻，使大塊組織沉淀，然后取上層細(xì)胞懸浮液，將上層細(xì)胞懸浮液靜止2030min,已見細(xì)胞沉淀， 用吸管吸取上層清液，留約1mL細(xì)胞懸浮液制備標(biāo)本。7. 標(biāo)本制備：取l張預(yù)先在蒸餾水中冷凍的清潔載玻片， 用滴管滴12滴細(xì)胞懸 浮液放于其上，立即將載玻片一端抬起，并輕輕吹氣，使細(xì)胞迅速分散。然后在酒精燈火焰上微微加熱烤干。8染色：Giemsa染液與1/15 mo1/L磷酸緩沖溶液pH值7.2。以20： 1混合， 分裝入染色缸中，將枯燥的制片置于染液中，染色 30 min左右，自來

45、水沖洗，空 氣枯燥后即可鏡檢。五考前須知1.在切取根尖時(shí)可將根冠一并切除，只留分生區(qū)，首先將根端部的外包皮用紗 布擦掉，可以看到泛白的根冠約 0.5mm和微泛黃的分生區(qū)5mm以內(nèi)，用 刀片切下先放到培養(yǎng)皿中的蒸餾水中，以防止在空氣中枯燥。2假設(shè)想保存根尖，在固定完畢用蒸餾水沖洗干凈固定液，參加75%乙醇于4C冰箱中保存?zhèn)溆茫脮r(shí)繼續(xù)下面的步驟。3 進(jìn)行酶解時(shí)，酶液一定要沒過材料。六實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察先在低倍鏡下進(jìn)行觀察，找到較好的中期分裂相后，直接加顯微鏡油并轉(zhuǎn)換 為油鏡頭進(jìn)行觀察。選取分散良好、顯示清晰的染色體組核型，進(jìn)行拍照，用于 下一步的核型分析。七思考題繪出所觀察的植物細(xì)胞中期染色體。實(shí)驗(yàn)九

46、植物染色體核型分析一實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解染色體核型分析的原理及各項(xiàng)參數(shù)意義。2. 學(xué)習(xí)染色體核型分析的方法。二實(shí)驗(yàn)原理各種動(dòng)植物的細(xì)胞中都有一定數(shù)目的染色體。染色體核型分析又稱組型分 析，就是分析細(xì)胞中染色體的數(shù)目和形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)， 并用表格、圖示將這些特點(diǎn) 展示出來。染色體的形態(tài)以有絲分裂中期最為顯著，所以一般都分析該時(shí)期染色體。染 色體的特征包括染色體數(shù)目、大小、著絲粒位置、副縊痕次縊痕的有無及位 置、隨體的有無及形態(tài)和大小、B染色體有無及數(shù)目等。If ft. Aluff4栽"圖8染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)染色體核型反映了物種染色體水平的整體特征，研究和比擬物種的染色體核 型可以確定物種本身的遺

47、傳學(xué)特征，有助于對物種的親緣關(guān)系進(jìn)行判斷和分析， 揭示遺傳進(jìn)化的過程和機(jī)制。核型分析也是分析生物染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的基 本手段，在染色體識(shí)別與鑒定中也起著重要作用，植物細(xì)胞分類學(xué)、細(xì)胞地理學(xué) 研究也是以核型分析為根底。三實(shí)驗(yàn)材料1 器具：毫米尺，鑷子，剪刀，計(jì)算器2 材料：黑麥、大麥、洋蔥等分散良好的中期細(xì)胞顯微照片四實(shí)驗(yàn)步驟1 測量：將洗印好的顯微攝影照片上的每條染色體進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)。測量每一條 染色體的總長度及長臂長度、短臂長度 單位：mm，自行制表。隨體長度不計(jì) 入染色體長度，但需標(biāo)注帶隨體染色體的編號(hào)。每條染色體的著絲粒應(yīng)平分為二， 計(jì)入兩臂長度之內(nèi)。如果染色體彎曲不能用直尺測量時(shí)，

48、可以先用細(xì)線量取與染 色體等長的長度，再用尺子量出線的相應(yīng)長度。2 計(jì)算：根據(jù)測量結(jié)果，計(jì)算出每條染色體的相對長度、臂比和著絲粒指數(shù)。相對長度=每條染色體長度/總?cè)旧w長度X100 精確到0.01絕對長度值僅在某些情況下有價(jià)值，因?yàn)樵谌旧w制片中，預(yù)處理時(shí)間、染色體濃縮程度、制片操作等都會(huì)影響絕對長度，所以，絕對長度值往往不穩(wěn)定，而相對長度那么是穩(wěn)定的可比擬數(shù)值。在組型研究中往往只采用相對長度。臂比值二長臂長度/短臂長度精確到0.01著絲粒指數(shù)=短臂長度/該染色體的長度X100%3. 配對：根據(jù)測量數(shù)據(jù)，比擬染色體的形狀、大小、相對長度、臂比、著絲粒 指數(shù)、副縊痕的有無及位置、隨體的有無等特征

49、進(jìn)行同源染色體配對。 注意隨體 是細(xì)胞中的某對同源染色體要么都帶隨體， 要么都不帶隨體。帶隨體的染色體用 SAT或星號(hào)“ *標(biāo)記。4排列：將配對的染色體按由大到小的順序進(jìn)行排列并編號(hào)。對于等長的染色 體，以短臂長的在前；有特殊標(biāo)記(如隨體)的染色體及性染色體排在后面。排 列時(shí)，把各對染色體的著絲粒排在一條直線上。短臂在上，長臂在下。5 分類：臂比值實(shí)際上反映的是著絲粒的位置，這個(gè)位置在一條染色體中是相 對固定的，因而是描述染色體特征的最有用的指標(biāo)。 現(xiàn)在最常用的著絲粒命名法 是Levan等(1964)提出的兩點(diǎn)四區(qū)系統(tǒng)，其規(guī)定見表 4。表4臂比值與著絲粒位置的關(guān)系臂比值著絲點(diǎn)位置1.00正中著

50、絲粒(median point)M1.01 1.70中部著絲粒區(qū)(median region)m1.7 0 3.00近中部著絲粒區(qū)(submedian regior)sm3.01 7.00近端部著絲粒區(qū)(subterminal region)st7.00以上端部著絲粒區(qū)(terminal region)tOO端部著絲粒區(qū)(terminal point)T6剪貼：將已經(jīng)粗剪過的每條染色體進(jìn)行細(xì)剪，使染色體周圍所留相紙相等， 假設(shè)染色體圖像清晰可以不留余邊，然后按排列順序整齊地粘在白紙上。一般是白 紙上方貼一張未剪的完整照片，中間貼上已剪出且按順序配對排列的染色體，見 表5。表5核型分析表序號(hào)相對

51、長度長臂長度短臂長度臂比值著絲粒類型1234五考前須知1 手工進(jìn)行分析時(shí)注意測量前應(yīng)進(jìn)行染色體編號(hào)，以免造成混亂。2 實(shí)驗(yàn)室提供的顯微照片應(yīng)選用染色體數(shù)目較少，染色體較大，分散情況較好 的制片。3 進(jìn)行核型分析時(shí)不要面向剪下的染色體大聲說話，以免染色體被吹跑喪失。4 剪貼時(shí)，一對染色體要排列緊密，不要有間隔，而每對之間要有間隔，著絲 粒都要排列在橫線上，并且排列整齊。六思考題1. 什么是核型？怎樣進(jìn)行核型分析？2 核型分析時(shí)，為何通常計(jì)算染色體相對長度而不是絕對長度?第二局部細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一特殊光學(xué)顯微鏡的原理和使用一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆账姆N比擬常用的特殊光學(xué)顯微鏡：熒光顯微鏡、暗視場顯微鏡、倒置

52、顯 微鏡和相差顯微鏡的原理、構(gòu)造和使用方法。二實(shí)驗(yàn)原理光學(xué)顯微鏡的分辨率通常為0.2卩m,這主要是由可見光的波長來決定的。 根據(jù)顯微鏡分辨率r 的公式：r=0.61 入 /nsin a兀照明光源的波長；n：聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率；a樣品對物鏡孔徑角的半角入的最小值為400nm 紫色可見光，sin 的最大值為1,如果用空氣作為聚 光鏡和物鏡之間的介質(zhì)折射率為1,其分辨率大約為0.3 um如果用油鏡作為 介質(zhì)折射率為1.5,其分辨率大約為0.2 ym。所以參考人眼0.2mm的分辨率, 光學(xué)顯微鏡的最大放大倍數(shù)為1000倍，油鏡的主要作用是提高分辨率。因此， 目前市面上所有顯微鏡的最大放大倍數(shù)

53、都是1000倍油鏡100倍，目鏡10倍。細(xì)胞生物學(xué)中常用的光學(xué)顯微鏡有：普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、相差顯 微鏡、暗視場顯微鏡、倒置顯微鏡、激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡。普通光學(xué)顯微鏡就是我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)所用的顯微鏡，又稱為正置明視場顯微 鏡?！罢弥傅氖钦彰飨到y(tǒng)在樣本下面而成像系統(tǒng)在樣本上面，與倒置顯微鏡 相區(qū)別。“明視場指的是成像時(shí)背景明亮，與暗視場顯微鏡相區(qū)別。下面介紹 一下幾種特殊的光學(xué)顯微鏡。1 熒光顯微鏡熒光顯微鏡是能夠觀察生物樣品中熒光現(xiàn)象的一種特殊顯微鏡。局部細(xì)胞 中的某些化合物，如葉綠素等，可以發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光。細(xì)胞中的大局部物質(zhì)或結(jié)構(gòu)不能發(fā)生熒光，需要用熒光染料染色后才能發(fā)出熒光

54、，稱為誘發(fā)熒光， 誘發(fā)熒光是利用熒光觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要方式。常用的熒光染料有吖啶橙AO,溴化乙啶EB，異硫氰基熒光素FITC, DAPI等。利用熒光現(xiàn)象可以觀察尺度 低于普通光學(xué)顯微鏡分辨率的生物結(jié)構(gòu)或分子組分，其原理類似于黑夜可以在飛 機(jī)上觀察到發(fā)光的手電筒。例如將細(xì)胞中的某一種蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的直徑為5nm左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于光學(xué)顯微鏡的分辨率0.2卩m進(jìn)行熒光染料染色后便可以觀察蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的位置。熒光顯微鏡的原理見圖9。照明光線LIGHT SOURCE首先通過濾光片1成 為單色光激發(fā)光，經(jīng)雙色鏡2反射到物鏡objective lens 聚焦到樣品object 。雙色鏡是一種特殊的鏡片，對激發(fā)光

55、不通透但可以通透樣品發(fā)出的 熒光。物鏡在熒光顯微鏡中同時(shí)起到聚光鏡將激發(fā)光聚焦的作用。樣品產(chǎn)生 的熒光通過雙色鏡和目鏡3成像進(jìn)入人眼。因此，通過熒光顯微鏡觀察到的圖像 背景為黑色，只有發(fā)生熒光的結(jié)構(gòu)才有相應(yīng)的圖像。LIGHTsouflce圖9熒光顯微鏡的 原理圖中顯示用藍(lán)光 作 為激發(fā)光產(chǎn)生綠 色 熒光，雙色鏡可以通 透綠光但不能通 透 藍(lán)光熒光顯微鏡的特點(diǎn)相對于普通光學(xué)顯微鏡來說，熒光顯微鏡添加的結(jié)構(gòu)主要有激 發(fā)光產(chǎn)生裝置和雙色鏡。2. 暗視場顯微鏡暗視場顯微鏡的主要用途是觀察顆粒性質(zhì)的樣品，如細(xì)菌顆粒。在普通顯 微鏡即明視場顯微鏡下觀察細(xì)菌顆粒時(shí)，由于沒有明顯的反差而不容易看清楚。通過暗視場顯微鏡觀察到的圖像為黑暗背景，樣品顆粒呈現(xiàn)出亮點(diǎn)，因此反差較 大，適于觀察。暗視場顯微鏡的主要原理是在聚光鏡(Condenser)前面加上一個(gè)圓形擋光 板(D