藥典三部版通則細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

1、1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法本法系利用邕試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。本試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止內(nèi)毒素的污染。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示，1EU與1個(gè)內(nèi)毒素國際單位（IU）相當(dāng)。細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁邕試劑靈敏度、標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)，干擾試驗(yàn)及檢查法中編號B和C溶液的制備、凝膠法中邕試劑

2、靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、光度測定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于干擾試驗(yàn)及檢查法中編號B和C溶液的制備、凝膠法中邕試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、光度測定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水應(yīng)符合滅菌注射用水標(biāo)準(zhǔn)，其內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法），且對內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用。試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250C>30分鐘以上）去除，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明

3、無內(nèi)毒素并且對試驗(yàn)無干擾的器具。供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要時(shí)，可調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般供試品溶液和邕試劑混合后溶液的pH值在6.08.0的范圍內(nèi)為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須經(jīng)過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。內(nèi)毒素限值的確定藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定：L=K/M式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性單位)表示；K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kgh)

4、表小，注射劑K=5EU/(kgh),放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kgh),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kgh);M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)或U/(kgh)表示，人均體重按60kg計(jì)算，人體表面積按1.62nf計(jì)算。注射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量(M)o按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。確定最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗(yàn)中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)(1-MVD),在不超過此稀釋倍數(shù)的

5、濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD:MVD=cL/入式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，c的單位需為mg/ml或U/ml,當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則c等于1.0ml/ml。如需計(jì)算在MVD時(shí)的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=X/L人為在凝膠法中邕試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml),或是在光度測定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。方法1凝膠法凝膠法系通過邕試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進(jìn)行限度檢測或半定量檢測內(nèi)毒素的方法。邕試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)在本檢查法規(guī)定的條件下，使邕試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為邕試劑的標(biāo)

6、示靈敏度，用EU/ml標(biāo)示。當(dāng)使用新批號的邕試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行邕試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。根據(jù)邕試劑靈敏度的標(biāo)示值（a,將細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2卜卜0.5人和0.25人四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒。取分裝有0.1ml邕試劑溶液的10m佛75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的邕試劑原安甑18支。其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕

7、輕混勻后，封閉管口，垂直放入37C+C的恒溫器中，保溫60分鐘及分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180。，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程中應(yīng)避免收到振動(dòng)，造成假陰性結(jié)果。當(dāng)最大濃度2人管均為陽性，最低濃度0.25入管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為邕試劑靈敏度的測定值（人株入c=antilg（EX/n）式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度；n為每個(gè)濃度的平行管數(shù)。當(dāng)入我0.52

8、入（包括0.5人和2入）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度人為該批邕試劑的靈敏度。干擾試驗(yàn)按表1制備溶液A、B、C和D,使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按邕試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表1凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備編R內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液一一一2B2入供試品溶液供試品溶液12482入1入0.5入0.25入4444C2入檢查用水檢查用水12入221入240.5入280.25入2D無/檢查用水一2注：A為供試品溶液；B為干擾試驗(yàn)系列；C為賞試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。只有

9、當(dāng)溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合邕試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，試驗(yàn)方為有效。當(dāng)系列濃度B的結(jié)果符合邕試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。其他情況則認(rèn)為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)?？赏ㄟ^對供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或

10、無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)邕試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。檢查法凝膠限度試驗(yàn)按表2制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和Bo按邕試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作表2凝膠限度試驗(yàn)溶液的制備內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液A無/供試品溶液2B2入供試品溶液2C2"檢查用水2D/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為供試品陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。結(jié)果判斷保溫60分鐘及分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B

11、的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗(yàn)有效。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。若供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A出現(xiàn)不符合規(guī)定時(shí)，需將供試品稀釋至MVD重新實(shí)驗(yàn)，再對結(jié)果進(jìn)行判斷。凝膠半定量試驗(yàn)本方法系通過確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C和D。按邕試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。結(jié)果判斷若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供

12、試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.52入，試驗(yàn)有效。系列溶液A中每一系列的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度。如果檢驗(yàn)的是經(jīng)稀釋的供試品，則將終點(diǎn)濃度乘以供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列內(nèi)毒素濃度c。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度按公式CE=antilg（!2c/2若試驗(yàn)中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于入（如果檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品，則記為小于人乘以供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)）。若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值

13、時(shí)，則判定供試品不符合規(guī)定。當(dāng)供試品溶液的所有平行管均為陽性，可記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以k表3凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備編R內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水1248一一一一2222B2入供試品溶液12入2C2入檢查用水檢查用水12482入1入0.50.25入2222D無/檢查用水一一一2注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗(yàn)的供試品溶液。從通過干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVDoB為2入濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽性對照）。C為賞試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列。D

14、為陰性對照。方法2光度測定法光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系利用檢測邕試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度或透光率）之間存在的量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光率所需的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測濁度增加速度的方法。顯色基質(zhì)法系利用檢測邕試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和

15、其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測反應(yīng)混合物的吸光度或透光率達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的檢測值所需要的反應(yīng)時(shí)間，或檢測值增加速度的方法。光度測定試驗(yàn)需在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37c蟲Co供試品和邕試劑的加樣量、供試品和邕試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說明進(jìn)行。為保證濁度和顯色試驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)以及供試品的干擾試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)當(dāng)使用新批號的邕試劑或試驗(yàn)條件有任何可能會影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制成溶液，制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于

16、10倍），最低濃度不得低于所用邕試劑的標(biāo)示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時(shí)要求做2支陰性對照，當(dāng)陰性對照的吸光度或透光率小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的檢測值或反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對值應(yīng)大于或等于0.980,試驗(yàn)方為有效。否則須重新試驗(yàn)。干擾試驗(yàn)選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為加），作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。表4光度測定法干擾試驗(yàn)溶液的制備編R內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液至少2B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)（或附

17、近點(diǎn)）的濃度（設(shè)為加）供試品溶液至少2C至少3個(gè)濃度（最彳點(diǎn)設(shè)定為a檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水至少2注：A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液。B為加入了標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知內(nèi)毒素濃度的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。C為如“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。D為陰性對照。按所得線性回歸方程分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs,再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率（R）R=(cs-ct)/RX100%當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%200%,則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍內(nèi)，須按“凝膠法干擾試驗(yàn)”中的方法去除干擾因素，并重復(fù)干擾試驗(yàn)來驗(yàn)證處理的有效性。當(dāng)邕試劑、供試品的來源、處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。檢查法按“光度測定法的干擾試驗(yàn)”中的操作步驟進(jìn)行檢測。使用系列溶液