大鼠整體低氧預(yù)處理減輕肺缺血再灌注損傷

1、大鼠整體低氧預(yù)處理減輕肺缺血再灌注損傷    【摘要】  目的： 探討低氧預(yù)處理（HPC）對(duì)肺缺血再灌注 ( I/R) 損傷的保護(hù)作用。方法： 重復(fù)性低氧5次建立大鼠HPC模型，雙活結(jié)套扎左側(cè)肺門45 min后再灌注120 min復(fù)制肺I/R損傷模型；設(shè)立對(duì)照組、I/R組和HPC +I/R組，每組10只大鼠，檢測(cè)各組肺組織濕重與干重比，肺組織丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性。結(jié)果： I/R組大鼠肺組織濕重

2、與干重比較對(duì)照組明顯增加 (P<0.05) ，肺組織SOD活性顯著降低(P<0.01), MDA含量和MPO活性明顯增高 (P<0.05)；HPC+I/R組大鼠上述指標(biāo)較I/R組均明顯改善，差異有顯著性。結(jié)論： 大鼠整體HPC可能通過(guò)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)肺的缺血再灌注損傷。【關(guān)鍵詞】  缺血; 肺； 再灌注損傷; 低氧預(yù)處理; 大鼠，Sprague-DawleyAbstractObjective: To investigate the&

3、#160;protective effect of hypoxic preconditioning (HPC) on lung ischemia-reperfusion injury in rats. Methods: HPC model was established with 5 times of repetitive sublethal hypoxia.

4、0;Thirty rats were randomly divided into the following three groups (n=10 in each): control group, ischemia-reperfusion injury group (group I/R), and group HPC+I/R. I/R injury 

5、;model rats underwent 45 min of left hilar ligation followed by 120 min of reperfusion. The ratio of wet/dry weight of lung tissue was measured and calculated. The&#

6、160;contents of malondialdehyde (MDA), and activities of superoxide dismutase (SOD) and myeloperoxidase (MPO) in lung tissue were determined with spectrophotometry. Results: In group I/

7、R,the wet/dry weight ratio of lung was significantly higher than that of control group (P<0.05), and the MDA content and MPO activity in lung tissue were dramatically&

8、#160;higher (P<0.05), SOD activity was significantly lower (P<0.01) than those of control group. In group HPC+I/R, that rats subjected to HPC, these oxidative stress indexes&

9、#160;were significantly improved when rats exposed to ischemia-reperfusion.Conclusion: Whole-body hypoxic preconditioning in rats can protect lung from I/R injury by reducing oxidative stres

10、s.Key words ischemia; lungs; reperfusion injury; hypoxic preconditioning; rats，sprague-dawley    缺血再灌注 (ischemia-reperfusion，I/R) 損傷現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來(lái),已受到廣泛關(guān)注。低氧或缺血預(yù)處理(hypoxic/ischemic preconditioning，HPC/IPC)是目前認(rèn)為能有效地防治I/R損傷的手段之一。越來(lái)越多的

11、研究表明，HPC/IPC產(chǎn)生的內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象不僅存在于多種動(dòng)物的心臟，而且存在于腦、肝和腎等多種器官和組織細(xì)胞，但其作用機(jī)制至今尚未完全闡明。臨床發(fā)現(xiàn)休克治療、心腦復(fù)蘇、肺栓塞治療后,肺都將經(jīng)歷I/R過(guò)程，且不可避免地受到不同程度的損傷。因此，肺I/R損傷及其所導(dǎo)致的肺功能障礙和防治也逐漸被人們重視。離體實(shí)驗(yàn)研究表明IPC對(duì)肺I/R損傷有保護(hù)作用1,2，但也有研究認(rèn)為大鼠左肺門5 min的IPC并不能減輕肺I/R損傷3。本實(shí)驗(yàn)在整體動(dòng)物水平上初步觀察大鼠經(jīng)HPC后對(duì)肺I/R損傷的保護(hù)作用。1  材料與方法1.1  材料 成年SD大鼠，

12、體重180210 g，雌雄不拘，由貴州省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。主要儀器有：動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司），低溫高速離心機(jī)（德國(guó), Eppendorf），核酸蛋白分析儀（美國(guó), Bio-Tek），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）。1.2  方法參考呂國(guó)蔚等4的方法，稍作改進(jìn)。將大鼠放入620 ml的廣口瓶?jī)?nèi)，立即用橡皮塞密閉，當(dāng)大鼠出現(xiàn)喘呼吸時(shí), 將大鼠取出并立即移

13、入另一個(gè)相同容積的廣口瓶?jī)?nèi)、密閉，如此反復(fù)操作5次，建立低氧預(yù)處理模型。10水合氯醛2 ml/kg腹腔麻醉, 氣管插管, 接動(dòng)物呼吸機(jī)。經(jīng)左前胸第5肋間開(kāi)胸,游離左側(cè)肺門,用生理鹽水稀釋肝素50 U至500 l經(jīng)尾靜脈注入，5 min后于肺充盈末用手術(shù)絲線通過(guò)肺門雙活結(jié)套扎左側(cè)肺門，45 min后松開(kāi)，再灌注120 min。對(duì)照組左肺門穿線但不結(jié)扎。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即取出左肺，切取中下段肺組織約0.2 g，置于新鮮配制的10中性福爾馬林固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，供HE染色；其余肺組織稱重后-7

14、0 凍存，以便分別進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)及計(jì)算肺濕重與干重比。取出已稱重的凍存的肺組織，放置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，80 連續(xù)烘烤24 h后取出，在電子天平上分別稱取肺組織干重，最后按公式計(jì)算：肺濕重與干重比值=（濕重-干重）/干重。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)制備樣品，并用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，再通過(guò)公式計(jì)算出組織勻漿液中的MDA含量、SOD活性和MPO活性。1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性。2  結(jié)果2.1&

15、#160; 形態(tài)學(xué)觀察    光鏡下，對(duì)照組肺泡腔內(nèi)無(wú)水腫、出血及壞死，間隔無(wú)增寬，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。肺I/R組肺泡腔內(nèi)明顯出血、水腫，血管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，并有局灶性肺氣腫，肺泡間隔增寬，偶見(jiàn)局灶性壞死，組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂。HPC+I/R組可見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量肺泡間隔出現(xiàn)斷裂，無(wú)明顯出血、水腫，組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍清晰，損傷程度較肺I/R組明顯減輕，見(jiàn)圖1。2.2  肺組織濕重與干重比值，見(jiàn)表1。結(jié)果表明HPC能減輕肺組織的I/R損傷，減輕肺水腫。表1  各組肺組織濕重與干重比值（略

16、）注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；  與I/R組比較，(2)P<0.05。2.3  肺組織MDA含量及SOD、MPO活性見(jiàn)表2。結(jié)果提示HPC能有效地抑制肺I/R時(shí)的氧化應(yīng)激反應(yīng)及中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的作用。表2  肺組織MDA含量及MPO、SOD活性的變化（略）注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；(2)P<0.01； 與肺I/R組比較：(3)P<0.05，(4)P<0.01。3  討論自1960年Jennings第一次提出I/R損傷的概念后，再灌注損傷日益受到重視。

17、1986年，Murry等5首先發(fā)現(xiàn)了IPC現(xiàn)象，之后人們以雞胚、鼠科動(dòng)物、兔、狗，乃至人體為研究對(duì)象，進(jìn)一步證明了IPC/HPC是機(jī)體抗缺氧或缺血的一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，但確切機(jī)制尚不明確，其可能的機(jī)制包括谷氨酸和腺苷受體激活、ATP敏感性鉀通道、一氧化氮、氧化應(yīng)激等。本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠HPC模型的基礎(chǔ)上，再?gòu)?fù)制大鼠單側(cè)肺I/R損傷模型，觀察HPC對(duì)肺I/R損傷的影響。肺I/R損傷后的基本病理改變是肺毛細(xì)血管通透性增高, 表現(xiàn)為血管內(nèi)滲出物增多、肺濕重與干重比值增加、蛋白漏出、肺通透性指數(shù)增高等6。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺I/R后，肺組織濕重與干重比值較對(duì)照組明顯增高，而經(jīng)過(guò)HPC后再進(jìn)行肺I/R，肺

18、組織濕重與干重比值明顯回降, 表明肺毛細(xì)血管損傷程度大大減輕。光鏡下，肺I/R組肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)明顯的出血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂；HPC+肺I/R組雖有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)及局灶性改變，但比肺I/R組肺組織病理改變明顯減輕，表明HPC減輕了I/R對(duì)肺組織的損傷作用。    肺I/R時(shí)由于氧自由基過(guò)量產(chǎn)生和組織抗氧自由基能力失衡, 導(dǎo)致大量氧自由基產(chǎn)生, 從而引起組織損傷。肺I/R時(shí)肺組織可以通過(guò)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)，白細(xì)胞“呼吸爆發(fā)”等途徑產(chǎn)生大量的氧自由基，同時(shí)內(nèi)源性的抗氧化酶類，如SOD等被消耗，導(dǎo)致抗氧化能力下降，

19、引發(fā)肺組織的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。MDA是過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物, 其含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺I/R組肺組織的SOD活性明顯降低，而MDA的含量明顯增高；HPC+肺I/R組雖然與對(duì)照組比較SOD有所降低，MDA含量有所增高，但差異無(wú)顯著性 (P>0.05)，但與I/R組比較差異有顯著性。這些結(jié)果表明，HPC可以顯著提高機(jī)體的抗氧化能力, 減輕肺I/R時(shí)氧自由基對(duì)肺組織的損傷，從而起到對(duì)肺的保護(hù)作用。MPO是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒所釋放的過(guò)氧化物酶類，其含量與中性粒細(xì)胞數(shù)量有極顯著的相關(guān)性, 檢測(cè)組織中MPO含量往往可以反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)

20、的程度及活性7。肺I/R損傷過(guò)程中，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、激活是引起肺I/R損傷的主要原因之一8 。實(shí)驗(yàn)顯示，肺I/R組肺組織MPO活性比對(duì)照組有明顯升高，而HPC+I/R組與 I/R組相比較明顯降低，表明肺I/R后有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、激活，引起肺組織損傷，而HPC后MPO活性明顯降低，說(shuō)明HPC能夠抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、激活，因而可起到減輕肺I/R損傷的作用。   本研究顯示，HPC能夠減輕肺組織的I/R損傷，這與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致9。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示HPC的保護(hù)作用可能通過(guò)改善肺毛細(xì)血管的通透性、減輕肺的氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少中性粒細(xì)胞的聚集等機(jī)制

21、得以實(shí)現(xiàn)。【參考文獻(xiàn)】  1 Featherstone RL, Chambers DJ, Kelly FJ. Ischemic-preconditioning enhances recovery of isolated rat lungs after hypothermic preservation J. Ann Thorac Surg, 2000(1): 

22、237.2李建華, 司志萍，盧佳怡，等.缺血預(yù)處理對(duì)大鼠肺缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用J. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2003(2): 137-140.3Pilla ES, Vendrame GS, Sánchez PG,et al.Ischemic preconditioning by selective occlusion of the pulmonary artery in rats J.

23、 J Bras Pneumol，2008(8):583-589.4呂國(guó)蔚, 史美棠, 李凌, 等。急性重復(fù)缺氧對(duì)小鼠缺氧耐受性的影響及其機(jī)制的初步探討J.中國(guó)病理生理雜志,1992(4):425-429.5Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury

24、60;in ischemic myocardium J. Circulation, 1986(74):1124-1136.6Friedrich I, Spillner J , Lu EX, et al. Ischemic pre-conditioning of 5 minutes but not of 10 minutes improves lung function after warm ischemia in a canine model J. J Heart Lung Transplant, 2001(9):985-995.7Bradley PP, Priebat DA, Christensen RD, et al. Measureme