酶失活動力學

1、編輯課件酶的失活動力學酶的失活動力學編輯課件 酶是一種不穩(wěn)定的物質，常因溫度，pH等因素的影響而產(chǎn)生不可逆的活力下降。 一般胞外酶較為穩(wěn)定，而胞內酶在外部環(huán)境中容易失活。 酶在保存和參與反應時均可能失活；酶在保存過程中的失 活又稱為酶的穩(wěn)定性，失活越快，說明酶的穩(wěn)定性降低。 酶的熱失活熱失活是最重要的一種酶失活形式，下面主要討論此種失活的動力學。編輯課件一、未反應時的熱失活動力學一、未反應時的熱失活動力學測定酶未反應時的熱失活動力學方法測定酶未反應時的熱失活動力學方法：在一定條件下，使酶溶液恒溫保持一定時間，然后在最適宜的pH和溫度下測定殘存的酶活力，即殘存酶活力。在不同溫度下反復測定，即可得

2、到一條曲線。該曲線可以表示酶的失活特性，稱為酶的熱失活曲線酶的熱失活曲線。若改變保溫時間，則會得到不同的熱失活曲線（圖1-1)。如果要了解酶在未反應時的失活速率，可將殘存的酶活力對其失活時間作圖，則又可得到一條曲線（圖1-2）。編輯課件圖1-1 不同溫度下的酶失活曲線圖1-2 不同時間下的酶失活曲線這些曲線反應了酶的生活規(guī)律。酶的熱變性失活很復雜，一般將其分為可逆失活與不可逆失活兩類，并提出了多種失活動力學模型。下面主要介紹一步失活模型。編輯課件1.一步失活模型一步失活模型（one step model)式中：式中：E活性酶活性酶D失活酶失活酶kd正反應的速率常數(shù)正反應的速率常數(shù)kr負反應的速

3、率常數(shù)負反應的速率常數(shù)編輯課件則活性酶的濃度隨時間的凈減少率或失活反應方程式可表示為：DrEdEckckdtdctt系統(tǒng)中酶的總濃度若以cE0表示，則存在下述關系式： cE0=cEt+cD (a)(b)將式(b)代入式(a)，并利用邊界條件t=0，cE0=cEt積分，經(jīng)整理可得下式：tkkkkkkccrddrrdEEtexp0(c)編輯課件對不可逆失活反應，kr=0,可得 cEt=cE0exp(-kdt) (d)多數(shù)酶的熱失活服從式(d)，kd可稱為一步失活常數(shù)一步失活常數(shù)或衰變常數(shù)衰變常數(shù)，單位為(時間)-1。kd的倒數(shù)稱為時間常數(shù)td。當cEt為cE0的一半的時間稱為半半衰期衰期，用t1/

4、2表示。kd、td和t1/2之間的關系為：21ddtln2t1k編輯課件2.多步失活模型多步失活模型（multi-step model)A 多半串聯(lián)失活模型多半串聯(lián)失活模型：酶的失活經(jīng)歷多步，即DFE。B 同步失活模型同步失活模型：全部酶分子可劃分為熱穩(wěn)定性不同的若干個組分，每個組分均符合一步失活模型。該模型全部酶中殘存酶活力的比率為： ktexpxcctiEE0式中：cE0表示酶的初始濃度；xi表示失活速率常數(shù)為ki的酶組分的分率。因此，1ix編輯課件3.溫度對酶失活的影響溫度對酶失活的影響 RTEAkdddexp對一級失活模型，有失活反應Arrihenius方程式中：kd表示衰變常數(shù)；Ad

5、表示失活反應Arrihenius方程的前指因子； Ed表示失活反應活化能。一般蛋白質的變性或失活的活化能為125kJ.mol-1，高于一般化學反應的活化能（2083kJ.mol-1）,這意味著酶失活對溫度十分敏感。同時考慮溫度和時間對酶失活影響的關系式 RTEtACCTtAddEEexpexp),(0編輯課件二、反應時的酶熱失活動力學二、反應時的酶熱失活動力學酶在反應中的穩(wěn)定性稱為操作穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性，可通過分批測定、連續(xù)測定及圓二色譜分析等方法測定。作不同溫度下反應轉化率隨時間的變化曲線，即反應過程曲線反應過程曲線，如圖2-1所示。圖2-1 不同溫度下酶促反應過程曲線(a) 以溫度T為參數(shù)，

6、轉化率X與時間t的關系曲線；(b) 以時間t為參數(shù)，轉化率X與溫度T的關系曲線編輯課件由圖(a)知時間一定時，隨著溫度的升高，反應速率增大，因而轉化率增大；但當溫度高到某一值時。其轉化率反而減少。因為當溫度升高到某一值時，酶的熱失活速率也在加速，致使有活力酶的量在減少，因而反應速率下降，最終為零。由圖(b)知：對于某一反應時間，存在一轉化率最高的溫度，該溫度稱為最佳溫度最佳溫度。不同的反應時間，有不同的最佳溫度。最佳溫度是溫度對酶催化速率和酶失活速率雙重作用的結果。編輯課件就底物濃度的變化對酶失活的影響，提出了下述模型：從上述機制看出，無論是游離酶，還是酶的復合物，均有可能失活，其失活速率方程

7、可表示為:tEsmsmdEccKcKkdtdct式中：121mkkkKsftEEEccc表示底物對酶失活的影響系數(shù)；cEf表示游離酶濃度。編輯課件根據(jù)上述模型可知：（1）當=0時，反應時酶失活速率達到最低。從反應機制中可以看出，復合物ES完全不失活，或者說酶完全被底物所保護酶完全被底物所保護。（2）當=1時，反應時與未反應時酶的失活速率完全相同。從反應機制中可以看出，復合物ES與游離酶E失活速率常數(shù)完全相同，或者說底物對酶底物對酶失活沒有影響。失活沒有影響。 （3）01時，反應時酶失活速率高于未反應時酶失活速率。從反應機制中可以看出，復合物ES失活速率常數(shù)大于游離酶E，或者說底物加速酶的失活底

8、物加速酶的失活。由上述分析可見，反映了底物對酶失活速率的影響，因此稱為底物對酶底物對酶失活影響系數(shù)失活影響系數(shù)（也稱為穩(wěn)定性影響系數(shù)穩(wěn)定性影響系數(shù)）。編輯課件若只有游離酶失活時，其分批反應的動力學方程為對于零級不可逆反應，cs值趨于無窮大，因此有：對該式積分，得到ss2mdEsms2scclnkKkccKckdtdc00tE2sckdtdct0E2ssdtckcctt0編輯課件當cs值足夠大時，可簡化為：tttEdEdEckckdtdc進行積分得到：代入式中積分得式中，k2,kd均為溫度的函數(shù)。t)kexp(ccdEE0tct kexp1kckccddE2ss0t0編輯課件三、失活動力學研究實

9、例三、失活動力學研究實例 以青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在甲醛溶液中的失活動力學的研究為例，通過在酶活力測定體系中加入不同濃度的甲醛，檢測酶的剩余活力(2-2)。研究顯示酶在甲醛溶液中的失活作用是一種可逆過程。建立失活動力學模型，可以測定游離酶(E)和結合酶(ES)的微觀失活速度常數(shù)(表d)。 圖2-2 酶在不同濃度甲醛中的失活作用動力學 (a)動力學過程；(b)半對數(shù)作圖。04代表不同濃度的甲醛編輯課件表d 青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在甲醛溶液中的失活速度常數(shù)從表d中可以看出，在相同濃度的甲醛溶液中，游離酶的正向微觀失活速度常數(shù)(k+0)是酶底物絡合物的失活速率常數(shù)(k+0)的35倍，表明游離酶比結合酶更容