PCR技術(shù)及習(xí)題

1、PCR技術(shù)及習(xí)題PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1、PCR原理：在解旋酶作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4中游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的。實(shí)際上就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3'端延伸DNA鏈。2、PCR反應(yīng)過程是：變性-復(fù)性-延伸類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火（復(fù)性）-延伸三個(gè)

2、基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：當(dāng)溫度上升到90以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：溫度下降到50左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合；引物的延伸：72c左右時(shí)，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5'端向3'端延伸。PCR以理示意圖翁有：DN%受"成為單族第一引為與限板互撲焙介第三步；延伸.形成新口雙世DMA3、結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的4、細(xì)胞被D

3、NA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較:細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制體外DNA擴(kuò)增（PCR）不同點(diǎn)“旋在解旋酶作用下邊解旋邊復(fù)制80100c高溫解旋，雙鏈完全分開bDNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶，物RNADNA、RNA，度體內(nèi)溫和條件高溫相同點(diǎn)需提供DNA模板四種脫氧核甘酸為原料子鏈延伸的方向都是從5'端到3'端知識(shí)點(diǎn)撥:1、DNA分子復(fù)制的人工控制解開螺旋：在80100c時(shí)，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性?；謴?fù)螺旋：在5060c左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。復(fù)制條件：緩沖液，DNA模板、四種脫氧核甘酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種引物?？刂苾x器：PCR

4、儀（溫度周期性自動(dòng)調(diào)節(jié)儀）。2、PCR的含義是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。3、PCR技術(shù)反應(yīng)的條件：穩(wěn)定的緩沖溶液環(huán)境（之間）；DNA模板；合成引物（2個(gè)）；四種脫氧核甘酸；DNA聚合酶；溫控設(shè)備4、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是快速、高效、靈活、易于操作。5、TaqDNA聚合酶的特點(diǎn)是：耐高溫。生物去買料fiilwwwLbtao.cOrri弓I物13一GAACTTT_5'5'GGATCTAGCGTATGCTTGAAA-X樽板DNA3、CCTAGATCGCA1ACGAACTTT5'3GGAICTA3'引物2圖1PCR引物與模板結(jié)合示意圖知識(shí)拓展：1、DNA聚合酶不能夠從頭合成DN

5、A,只能從DNA的3'端開始延伸DNA鏈,因此DNA復(fù)制需要引物。2、引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核甘酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。(1)PCR引物通常長(zhǎng)15-25堿基，其中G+C約占50%。(2引物之間不能互配形成雙鏈結(jié)構(gòu)，引物內(nèi)部也不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。(3引物的3末端必須與目的片段完全相配。(4)引物的5末端可以不與目的片段互補(bǔ)，可以包含內(nèi)切酶位點(diǎn)或啟動(dòng)子序列，但在下一輪反應(yīng)中，這些序列會(huì)被同樣合成習(xí)題訓(xùn)練1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是在

6、實(shí)驗(yàn)室中以少量樣品DNA制備大量DNA的生化技術(shù)，反應(yīng)系統(tǒng)中包括微量樣品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4種脫氧核甘酸及ATP等。反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，故DNA數(shù)以指數(shù)方式擴(kuò)增，其簡(jiǎn)要過程如右圖所示。循環(huán)重復(fù)(1)某個(gè)DNA樣品有1000個(gè)脫氧核甘酸，已知它的一條單鏈上堿基A:G:T:C=1:2:3:4,則經(jīng)過PCR儀五次循環(huán)后，將產(chǎn)生個(gè)DNA分子，其中需要提供胸腺喀咤脫氧核甘酸的數(shù)量至少是個(gè)。(2)分別以不同生物的DNA樣品為模板合成的各個(gè)新DNA之間存在差異，這些差異是。(3)請(qǐng)指出PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)錄過程的三個(gè)不同之處：。2 .通過DNA重組技術(shù)使原有基因得以改造

7、的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。運(yùn)用這一技術(shù)使羊奶中含有人體蛋白質(zhì)，下圖表示了這一技術(shù)的基本過程，在該工程中所用的基因剪刀”能識(shí)別的序列和切點(diǎn)是一GGATCC一，請(qǐng)回答:羊蛋白咫呆黑案色體上的其他基因表達(dá)分泌的K%中含人體生臼瓜小方下的折白膜基氏人滓,白質(zhì)基因插入到羊染色體中(1)從羊染色體中剪下”羊蛋白質(zhì)基因的酶是人體蛋白質(zhì)基因插入”后連接在羊體細(xì)胞染色體中時(shí)需要的酶(2)請(qǐng)畫出質(zhì)粒被切割形成黏性末端的過程圖-GfGATCC(3)人體蛋白質(zhì)基因之所以能插入”到羊的染色體內(nèi)，原因是插入”時(shí)常用的工具3 .下面甲圖中DNA決定某一多肽鏈中的酪氨酸和丙氨酸過程示意圖，乙圖示樣品DNA經(jīng)PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

8、反應(yīng))擴(kuò)增，可以獲取大量DNA克隆分子分析回答：1IDMA拜師2TUMAJTT雷白腦酷蚊酸內(nèi)氨磁甲建（1）甲圖中含有種核甘酸；丙氨酸的遺傳密碼子是。該圖表示了DNA中遺傳信息的過程。（2）有一種貧血癥是血紅蛋白分子的一條多肽鏈上，一個(gè)酪氨酸被一個(gè)苯丙氨酸所替代造成的。此種貧血癥的根本原因是,即發(fā)生了改變。（3）乙圖的“PCR與人體內(nèi)的DNA復(fù)制相比有何特殊之處？。（4）現(xiàn)在要通過“PCR得到甲圖中DNA片段的1024個(gè)克隆片段，則至少要向試管中加入個(gè)腺喋吟脫氧核甘酸。PCR檢測(cè)上崗證試題一、選擇題（共20題，每題2分）1、PCRfc術(shù)擴(kuò)增DNA需要的條件是（）目的基因引物四種脫氧核甘酸DNA5

9、合酶等mRNA核糖體AB、C、D、2、鎂離子在DNMRNA#外擴(kuò)增反應(yīng)的濃度一般為（）3、多重PCR!要的引物對(duì)為（）A、一對(duì)引物B、半對(duì)引物C、兩對(duì)引物D、多對(duì)引物4、PCR在引物、模板和4種脫氧核糖核甘酸存在的條件下依賴于DNA合酶的酶促合成反應(yīng)，其特異性決定因素為（）A、模板B、引物C、dNTPD、鎂離子5、在PCRK應(yīng)中，下列哪項(xiàng)可以引起非靶序列的擴(kuò)增的擴(kuò)增（）A、TaqDNAS合酶加量過多B、引物加量過多C、A、B都可D、緩沖液中鎂離子含量過高A、MullisB、史蒂文.沙夫C、蘭德爾.才木7、PCRT物短期存放可在（）保存。A、4B、常溫C、-80D、高溫8、PCRT物長(zhǎng)期儲(chǔ)存最好

10、置于（）。A、4B、常溫C、16D、-209、PCR勺基本反應(yīng)過程包括（）A、變性、退火、延伸B、變性、延伸C、變性、退火10、在實(shí)際工作中，基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室污染類型包括（）A、擴(kuò)增產(chǎn)物的污染B、天然基因組DNA勺污染C、試劑污染和標(biāo)本間交叉污染DA、B、C都可能11、PCRK術(shù)于哪一年發(fā)明（）A、1983B、1971C、1987D、199312、TaqDN咪合酶酶促反應(yīng)最快最適溫度為（）A、37B、50-55C、70-75D、80-8513、以下哪種物質(zhì)在PCRK應(yīng)中不需要（）ATaqDNA聚合酶B、dNTPsC、鎂離子D、RNAS14、PCR僉測(cè)中，經(jīng)過n個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，拷貝數(shù)將增加（）A、n

11、B、2nC、2nD、n215、PCRS因擴(kuò)增儀最關(guān)鍵的部分是（）A、溫度控制系統(tǒng)B、熒光檢測(cè)系統(tǒng)C、軟件系統(tǒng)D、熱蓋16、以下哪項(xiàng)不是臨床PCRK驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則（）A、各區(qū)合并B、注意風(fēng)向C、因地制宜D、方便工作17、PC雙驗(yàn)室一般包括（）A、試劑準(zhǔn)備區(qū)B、標(biāo)本制備區(qū)C、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)D、A、B、C都含18、PCRK術(shù)不僅為遺傳病的診斷帶來了便利，而且改進(jìn)了檢測(cè)細(xì)菌和病毒的方法。若要檢測(cè)一個(gè)人是否感染了艾滋病病毒，你認(rèn)為可以用PCR擴(kuò)增血液中的（）。A、白細(xì)胞DNAR病毒蛋白質(zhì)C、血漿抗體D、病毒核酸19、如果反應(yīng)體系中加入模板DN的子100個(gè)，則經(jīng)過30個(gè)循環(huán)后，DNA子）個(gè)。230

12、A100X30B、100X30X2C、100X30D100X220、PCFT增產(chǎn)物的分析方法主要有（）A、凝膠電泳分析法B、點(diǎn)雜交法C、熒光探針定量PCRtD、A、BC都是二、判斷題（共20題，每題2分）1、PCRSI物設(shè)計(jì)的目的是在擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率問問取得平衡。（）2、在PCRE應(yīng)中，dATP在DNAT增中可以提供能量，同時(shí)作為DN始成的原料。（）3、DNAT增過程未加解旋酶，可以通過先適當(dāng)加溫的方法破壞氫鍵，使模板DNA解旋。（）4、PCR反應(yīng)中，復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成。（）5、PCRf細(xì)月fi內(nèi)DNAS制相比所需要酶的最適溫度較高。（）6、PCR

13、K術(shù)可用于基因診斷，判斷親緣關(guān)系等。（）7、PCRK術(shù)需在體內(nèi)進(jìn)行。（）8、PCRK應(yīng)體系中的緩沖液相當(dāng)于細(xì)胞中的體液。（）9、核酸的復(fù)制是由5->3/方向進(jìn)行的。（）10、配對(duì)的堿基總是A與T和G與C。（）11、HBsAg轉(zhuǎn)陰性后一段時(shí)間才出現(xiàn)可檢測(cè)的HBsAb,此段間隔期稱之為“窗口期”。（）12、市面上多數(shù)試劑用淬滅基團(tuán)Q基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)R基團(tuán)來標(biāo)記熒光定量PCR的探針。（）13、PC網(wǎng)應(yīng)體系中Mg2+的作用是促進(jìn)TaqDNA聚合酶活性。（）14、若標(biāo)本中含有蛋白變性劑（如甲醛），PH、離子強(qiáng)度、Mg2+等有較大改變都會(huì)影響Taq酶活性。（）15、每個(gè)子代DNA分子中均保留一條親代DNA鏈和一條新合成的DNA鏈，這種復(fù)制方式稱之為半保留復(fù)制。（）16、發(fā)生溶血的標(biāo)本對(duì)PCR結(jié)果沒影響。（）17、“平臺(tái)效應(yīng)”是描述PCR后期循環(huán)產(chǎn)物對(duì)數(shù)累積趨于飽和。（）18、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetr