氣液色譜分析

1、色譜分類方法：1 .按固定相外形：柱色譜（填充柱、空心柱毛細(xì)管柱色譜）、平板色譜（薄層色譜和紙色譜）2 .按組分在固定相上的分離機(jī)理：吸附色譜：不同組分在固定相的吸附作用不同；分配色譜：不同組分在固定相上的溶解能力不同；離子交換色譜：不同組分在固定相（離子交換劑）上的親和力不同；凝膠色譜（尺寸排阻色譜）不同尺寸分子在固定相上的滲透作用3 .按兩相狀態(tài)分類方法固定相平衡類型適用氣相 色譜氣液色譜固定液吸附于惰 ，儲(chǔ)體（擔(dān)體）氣液間分配小分子量氣體及燒類，如大氣成分分析氣體試 樣或能 被氣化 的固體 和液體 試樣氣固色譜固體吸附劑吸附、解吸氣相鍵合色譜有機(jī)組分鍵合于 固體表面氣體和鍵合體表向 間的

2、分配液相 色譜液液色譜固定液吸附于惰 ，懊體不相溶液體間的分 配高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相 對(duì)分子質(zhì)量大得有機(jī)物液固（吸附） 色譜固體吸附劑吸附、解吸液相鍵合色譜離子交換色譜有機(jī)組分鍵合于 固體表面 離子父換樹脂液體和鍵合體表向 間的分配離子父換離子對(duì)色譜法空間排阻色譜 法/凝膠滲透色 譜法液體附于多孔聚 合物分配/篩析（多孔性 物質(zhì)對(duì)/、同大小分 子的排阻作用/、 同）超臨 界色 譜有機(jī)組分鍵合于 固體表面超臨界流體和鍵合 相間分配4.HPLC液相色譜中按固定相和流動(dòng)相極性大小分為：正相色譜（固定相極性大于流動(dòng)相, 極性小的先流出，適于極性組分分離）、反相色譜（固定相極性小于流動(dòng)相，極性大的先流

3、出，適于非極性組分分離）GC毛細(xì)管柱氣相色譜的特點(diǎn)：（i）滲透性好：可使用較長(zhǎng)的色譜柱；（ii）相比率大：有利于提高柱效；加上保留因子k小，滲透性好，可使用很高的載氣流速,因而分析速度快；（iii）柱容量?。阂蚨M(jìn)樣量小。需采用分流技術(shù)并使用更高靈敏度的檢測(cè)器；（iv）總柱效高：盡管毛細(xì)管柱效比填充柱大，但仍處于同一數(shù)量級(jí)。但毛細(xì)管柱長(zhǎng)很大，因而總柱效高，分離復(fù)雜混合物能力強(qiáng)。色譜分離方法的選擇試樣分子量水溶性、離解性方法流動(dòng)性物質(zhì)種類>2000溶于水排阻色譜水不溶于水排阻色譜非水<2000不溶于水正/反相色譜同系物吸附色譜異構(gòu)體多功能團(tuán)排阻色譜分子大小差異溶于水，不解離反相色譜排

4、阻色譜（小孔）水溶于水，可解離陽離子交換色譜堿陰離子交換色譜酸溶于水，離子與 非離子反相離子對(duì)色譜固定相：固體吸附劑、固定液 +載體固定液：1。要求：a）熱穩(wěn)定性好、蒸汽壓低 一一流失少；b）化學(xué)穩(wěn)定性好 一一不與其它 物質(zhì)反應(yīng)；c）對(duì)試樣各組分有合適的溶解能力（分配系數(shù)K適當(dāng)）；d）對(duì)各組分具有良好的選擇性2 .固定液與組分的作用力：a）色散力一一非極性分子之間b）誘導(dǎo)力一一極性與非極性分子之間 c）取向力一一極 性與極性分子之間d）氫鍵力靜電吸引，亦屬取向力。3 .固定液的選擇：固定液的特性參數(shù)：相對(duì)極性0<P<100; 固定液特性常數(shù)羅氏常數(shù)、麥?zhǔn)铣?shù)固定液選擇：按相似相溶”

5、原理選擇固定液。非極性組分一一非極性固定液 一一沸點(diǎn)低（小分子物質(zhì)）的物質(zhì)先流出；極性物質(zhì)一一極性固定液一一極性小的物質(zhì)先流出；各類極性混合物 一一極性固定液一一極性小的物質(zhì)先流出；氫鍵型物質(zhì)一一氫鍵型固定液一一不易形成氫鍵的物質(zhì)先流出；復(fù)雜混合物一一兩種或以上混合固定液極性：正己烷環(huán)己烷苯甲苯按化學(xué)基團(tuán)相似原則選擇；按組分主要性質(zhì)差別選擇HPLC的流動(dòng)相：HPLC流動(dòng)相為溶劑（其極性、粘度、 PH值、濃度等均可改變，可調(diào)節(jié) 樣品在兩相間分配的差異），它既有運(yùn)載作用，又和固定相一樣，參與對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，因此 溶劑的選擇對(duì)分離十分重要。理想的溶劑應(yīng)有下列特性：1）對(duì)待測(cè)物具一定極性和選擇性；2）使

6、用UV檢測(cè)器時(shí)，溶劑要匹配；使用折光率檢測(cè)器，溶劑的折光率要與待測(cè)物的折光率有較大差別；3）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰；4）化學(xué)穩(wěn)定性好；5）適宜的粘度。粘度過高，柱壓增加；過低，易產(chǎn)生氣泡。為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。固定相（P77 ,70色譜法）HPLC通常按固定相的不同分為多種類型各種色譜方法如液液色譜法、液固色譜法、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法等1、液液分配色譜根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過程。2-

7、離子交換色譜一一原理：利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能力）的 差別來實(shí)現(xiàn)分離的。3、離子對(duì)色譜法（IPC）將與待測(cè)物離子 A電荷相反的離子 B （稱為對(duì)離子或反離子）加入到流動(dòng)相中，使待測(cè)離子與對(duì)離子形成離子對(duì) AB ,該AB離子對(duì)的性質(zhì)與 A離子或B離子的性質(zhì)不同，即間接改 變了待測(cè)離子的保留特性。4、尺寸排阻色譜法固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測(cè)物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測(cè)物分子按分子大?。ǚ肿恿看笮。┫群髲闹辛鞒?。、色譜分析的基本原理：

8、借在兩相間分配原理而使混合物中各組分分離。 根據(jù)組分與固定相與流動(dòng)相的作用力不同，當(dāng)兩相做相對(duì)移動(dòng)時(shí)，各組分在兩相中反復(fù)多次分配（/吸附解吸）而相互分離，依次流出色譜柱，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)、氣相色譜的理論基礎(chǔ)：色譜的分離行為應(yīng)從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面進(jìn)行研究、解釋。1 .試樣中各組分在兩相間的分配情況，由組分在兩相間的分配由分配系數(shù)（熱力學(xué)性質(zhì)）、各物質(zhì)（試樣中的組分、固定相、流動(dòng)相）的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)決定，它使得各組 分在不同時(shí)間流出一一峰間距，由各個(gè)色譜峰在柱后出現(xiàn)的時(shí)間（保留值）反映;2 .各組分在色譜柱中的運(yùn)動(dòng)（分散）情況，由傳質(zhì)和擴(kuò)散（動(dòng)力學(xué)性質(zhì)）決定，它使得各組 分峰有一定的寬度 一一

9、峰寬，由峰寬反映。描述分配過程的參數(shù):Cs cmK與組分和兩相的性質(zhì)、柱溫、柱壓有關(guān)，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關(guān)。組分在固定相中的質(zhì)msc5Vs k=片鼠：反映了組分在3 分酉F卜匕 k =組分在流動(dòng)相中的質(zhì)林 CmVm柱中的遷移速率，是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的重要參數(shù)。與組分和兩相的性質(zhì)、柱溫、 柱壓和相比有關(guān)。K = = ms/Vs = kVm = kP （p稱為相比率，是反映色譜柱柱型及其結(jié)構(gòu)的參數(shù)） cmmm /VmVs4 .選擇因子（相對(duì)保留值r2i） a色譜柱對(duì)A、B兩組分的選擇因子 a為 , _ .tr（B） kBKb0 =t7肉=k =K1A為先流出的組分，B為后流出

10、的組分。K或k反映的是某一組分在兩相間的分配；而a是反映兩組分間的分離情況！兩組分在兩相間的分配系數(shù)不同，是色譜分離的先決條件。色譜分離的基本理論：（GC） 1.塔板理論（將色譜柱當(dāng)作精微塔，用塔板概念來描述組分在 柱中的分配行為 ）'理論塔板數(shù)：n =5.54（L）2 =16（上）2有效塔板數(shù) nef =5.54（L）2 =16（上）2W1/2W皿/2 W有效塔板高度 Heff =L （普通柱的 “爐為0.1cm） neff塔板理論 描述了組分在柱內(nèi)的分配平衡和分離過程、導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型、解釋了流出曲線形狀（呈正態(tài)分布）和位置、提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)（說明柱效柱 分離能力的

11、發(fā)揮程度時(shí)，必須注明該柱效是針對(duì)何種物質(zhì)、固定液種類及其含量、流動(dòng)相種類及流速、操作條件等），但該理論是在理想情況下導(dǎo)出的，未考慮分子（縱向）擴(kuò)散因 素、其它動(dòng)力學(xué)因素對(duì)柱內(nèi)傳質(zhì)的影響。它不能解釋：峰形為什么會(huì)擴(kuò)張等動(dòng)力學(xué)問題，也不能預(yù)言分離白可能（由 K和柱效決定），不能解釋同一色譜柱在不同載氣流速下柱效不同 的原因。H 二 A ' Cu （GC/HPLC） 2.速率理論（GC、HPLC van Deemter 方程：u曲線的最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)最佳線速"'"4 下的最小板高底；u為流動(dòng)相線速度；A, B, C為常數(shù)，其中 A 一分別表示渦流擴(kuò)散系數(shù)； B一分子擴(kuò)散

12、系數(shù)；C 一傳質(zhì)阻力系數(shù)（包括液相和固相傳質(zhì)阻力系數(shù)）。從動(dòng)力學(xué)角度很好地解釋了影響板高（柱效）和峰擴(kuò)張的各種因素GC 、HPLC定義減小措置說明各 因渦流擴(kuò) 散項(xiàng)A受到填裝不均大小不一的固定相顆粒的 阻礙，組分在遷移過程中隨流動(dòng)相不斷細(xì)粒的固定相并填充 均勻。對(duì)于空心毛 細(xì)管柱，無渦素 相改變方向，形成紊亂的渦流”，導(dǎo)致同流擴(kuò)散，即互一組分運(yùn)行路線長(zhǎng)短/、同一流出時(shí)間/、A=0。制同一峰形展寬。約分子當(dāng)樣品被注入色譜柱時(shí)，它呈塞子”狀球狀顆粒；流速低時(shí)主( 縱且不充滿色譜柱而產(chǎn)生濃度梯度。隨著大分子量流動(dòng)相；導(dǎo)（GC）向）擴(kuò) 散項(xiàng)B/u流動(dòng)相的推進(jìn)， 塞子”因濃度梯度而向 前后自發(fā)地?cái)U(kuò)散，使

13、譜峰展寬。適當(dāng)增加流速； 短柱；低溫。HPLC 可忽略傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cu因傳質(zhì)阻力的存在，使分配不能瞬間”達(dá)至平衡，因此產(chǎn)生峰形展寬。氣相傳質(zhì)阻力和液相傳質(zhì)阻力均有A:流動(dòng)相傳質(zhì)阻力（流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)和滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)）B:固定相傳質(zhì)阻力（從兩相界面到固定相內(nèi)部 的質(zhì)量交換，在液液分配色譜中取決于 固定液的液膜厚度）減小填充顆粒直 徑；采用分子量小 的流動(dòng)相；減小液 膜厚度，但此時(shí)k減 ?。ㄔ黾訐?dān)體表面積， 一固定液越多；但比 表面積過大會(huì)因吸附 過強(qiáng)而使峰型拖尾） 增加柱溫（但k值 也減小）GC流速高 時(shí)、HPLC主 導(dǎo)（流速/、宜 快）流動(dòng)相傳質(zhì)阻力：a流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)：流動(dòng)相通過

14、色譜柱內(nèi)的固定相時(shí)，靠近固定相顆粒的流動(dòng)相流動(dòng)稍慢而對(duì)較遠(yuǎn)的稍快的液體產(chǎn)生的阻力；b滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)：固定相由于多孔性造成部分流動(dòng)相在局部滯留，而流動(dòng)相中的試樣分子要與固定相進(jìn)行質(zhì)量交 換，則會(huì)受到滯留區(qū)的阻力一3.分離度及色譜分離方程（GC）分離度（同時(shí)反映色譜柱效能和選擇性的綜合指標(biāo)）R 2。一,定義為：W1 W2n eff 二 一 1)R =()1 十k、4-R越大，相鄰組分分離越好。當(dāng) R=1.5時(shí)，分離程度可達(dá)99.7%,通常用作是否分開的 判據(jù)、n - -1R =（）（色譜分離方程：4：將R與影響其大小的因素：柱效 n （由（旦）2 = n1 =且知增加柱長(zhǎng)可提高 R,但使R2

15、n2 L2分析時(shí)間T）、選擇因子a （aT一柱的選擇性T- RT ;降低柱溫、改變固定相和流動(dòng)相的 性質(zhì)和組成） 和保留因子 k （k T - R T ,但需在一定范圍；增加柱溫、固定相和流動(dòng)相 性質(zhì)和組成、固定相的量）聯(lián)系起來,一氣相色譜分離分析條件1 .固定相的選擇一一相似原理2 .柱長(zhǎng)L3 .載氣及流速u之間4 .柱溫：在固定液最高使用溫度和最低使用溫度（固定液的凝固點(diǎn)點(diǎn)）傳質(zhì)快' 柱效高升高縱向一一強(qiáng)、RI恒溫:實(shí)套確定程序升 最（宛沸程混合物）罐型變定變高/低沸點(diǎn)組分罐重要柱溫固定液潼失H看.選擇性f降低I分析時(shí)間長(zhǎng)在使最難分離的組分盡可能好的分離的前提下，采取較低的溫度。對(duì)

16、于沸點(diǎn)范圍較寬的試樣，宜采用程序升溫，使低沸點(diǎn)及高沸點(diǎn)組分都能在各自適宜的溫度下得到良好的分離。5 .載體粒度及篩分范圍載體粒度越小，柱效越高。但粒度過小，則阻力及柱壓增加。6 .進(jìn)樣方式及進(jìn)樣量要以 塞子”的方式進(jìn)樣，以防峰形擴(kuò)張；進(jìn)樣量，也要以峰形不拖尾為宜。改善分離效果方法：1.程序升溫：使柱溫按預(yù)定的加熱速率，隨時(shí)間做線性或非線性的增加，使低沸點(diǎn)及高沸點(diǎn)組分都能在各自適宜的溫度下得到良好的分離，以保持較好峰型（寬沸點(diǎn)試樣）2 .梯度洗提（梯度洗脫）：流動(dòng)相中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按 一定的程序連續(xù)改變流動(dòng)相中溶劑的配比和極性，通過流動(dòng)相中極性的變化來改變被分離組

17、分的容量因子和選擇性因子，以提高分離效果。3 .化學(xué)鍵合固定相：用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把固定液有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面所形成 的固定相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法為化學(xué)鍵合色譜法。4 .其他：程序改變流速；組合柱等方法。GC載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)柱分離系 統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)（+記錄系統(tǒng)）獲得純凈、連 續(xù)、流速穩(wěn)定的 載氣將試樣在進(jìn)入色 譜柱前瞬間氣化， 后快速定量轉(zhuǎn)入 色譜柱中TCD、FID、FPD、ECD把混合物中被分離的各 組分的濃度或質(zhì)量轉(zhuǎn)換 成電信號(hào)的裝置溫控系統(tǒng)：主要指對(duì)色譜柱室、氣化室、檢測(cè)器的溫度控制：HPLC高壓輸液裝置進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)（+記錄系統(tǒng)）增加高壓泵以 提高流動(dòng)相的 流

18、動(dòng)速度，克服 阻力紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器 及電化學(xué)檢測(cè)器等各組分的 分離可與MS等聯(lián)用；結(jié)果為 色譜流出曲線一、色譜流出曲線（色譜圖）1 .相關(guān)術(shù)語：基線、保留值表示試樣中各組分在色 譜柱中的滯留時(shí)間。包括死時(shí)間 tM、保留時(shí)間tR、調(diào)整保留時(shí)間tR =tR -tM、死體積VM、保留體積Vr、調(diào)整保留體積Vr相對(duì)保'留值r2 1 =r2（ r2,1只與柱 ,tM VM溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱內(nèi)徑、柱長(zhǎng) L、填充情況及流動(dòng)相流速無關(guān)）區(qū)域?qū)挾龋喊?biāo)準(zhǔn)偏差、半峰寬度、峰底寬度峰高、峰面積2 .色譜流出曲線的意義：色譜峰數(shù)=樣品中單組分的最少個(gè)數(shù)；色譜保留值一一定性依據(jù)；色譜峰高或面積

19、一一定量依據(jù)；色譜保留值和區(qū)域?qū)挾?一一色譜柱分離效能評(píng) 價(jià)指標(biāo)（分離好壞）；色譜峰間距一一固定相或流動(dòng)相選擇是否合適的依據(jù)。二、進(jìn)樣器：注射器（進(jìn)樣優(yōu)點(diǎn)：死體積小一結(jié)果精確度高；缺點(diǎn)：定量不準(zhǔn)確一重復(fù)性差）、六通閥/多通進(jìn)樣閥（與注射器相反）三、GCWW'ai（ 1）適合的靈敏度s （單位小品量/質(zhì)量的改變引起的信號(hào)改變）（2）穩(wěn)定、重現(xiàn)，訪173mBM工j處進(jìn)樣量與最小檢出限的比值）寬，可達(dá)幾個(gè)數(shù)量級(jí)；-（4）響應(yīng)時(shí)間短，且不受流速影響；（5）選擇性好；（6）不反而而'fWEBJDjJnBN/S ,N為檢測(cè)器的噪聲）J種類：1.熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD; 2.氫火焰離子化檢測(cè)器 F

20、ID; 3.電子捕獲檢測(cè)器ECD;4.火焰光度檢測(cè)器 FPD;1 .熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD）濃度型檢測(cè)器適用于各類氣相物質(zhì)原理：由于不同物質(zhì)所具有的熱傳導(dǎo)系數(shù)不同，當(dāng)它們到達(dá)處于恒溫下的熱敏元件（如Pt, Au,W,半導(dǎo)體）時(shí)，其電阻將發(fā)生變化，將引起電阻變化通過某種方式轉(zhuǎn)化為可以記錄的電壓 信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)其檢測(cè)功能。影響因素：較大的橋電流、較低的池體溫度、低分子量的載氣以及具有大的電阻溫度系 數(shù)的熱敏元件可獲得較高的靈敏度。2 .氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）質(zhì)量型檢測(cè)器應(yīng)用：含碳有機(jī)物如燒類，不用于不電離無機(jī)化合物，如水、永久性氣體等含碳有機(jī)物在氫焰中燃燒時(shí)，發(fā)生化學(xué)電離反應(yīng)產(chǎn)生的正負(fù)離子，在電場(chǎng)作用下定向移動(dòng)形成微電流，經(jīng)過高電阻產(chǎn)生電壓，放大后被檢測(cè)器檢測(cè)。影響因素：載氣和氫氣流速：通常以N2為載氣，其流速主要考慮其柱效能。但也要考慮其流速與H2流速相匹配。）空氣流速：一定范圍內(nèi)，空氣流速越大，靈敏度越大； 操作溫度3 .電子捕獲檢測(cè)器（ECD）主要對(duì)含有較大電負(fù)性原子的化合物響應(yīng)。特別適合于環(huán)境樣品中鹵代農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯等微量污染物的分析。4 .火焰光度檢測(cè)器（FPD）主要用于含硫和含磷的有機(jī)物定性分析方法（依據(jù)保留值）1、用未知物保留值與已知物對(duì)照定性（單柱法、雙柱法、多柱法、峰高增量定性）2 .據(jù)經(jīng)驗(yàn)式定性：碳