蛋白質(zhì)含量測定方法匯總

1、實驗七蛋白質(zhì)含量測定(Biuret)法，酚試劑法測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有染料法，雙縮脲 (Lowry)法及紫外吸收法。目的要求1 掌握測定蛋白質(zhì)的含量基本方法。2 了解染料法、雙縮脲法、Lowry法和紫外吸收法測定原理。、染料法實驗原理在酸性溶液中染料考馬斯亮藍G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合，此時考馬斯亮藍G-250顏色從紅色變?yōu)樗{色，吸收高峰從460nm移至595nm。利用這個原理可以測定蛋白質(zhì)含量。該法近年在某些方面有取代經(jīng)典的Lowry法趨勢，因為它操作簡單，反應(yīng)時間短，染料-蛋白質(zhì)顏色穩(wěn)定，抗干擾性強。本法的缺點是：對于那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白氨基酸組成有較大差 異的蛋白質(zhì)，有一定誤差，

2、因為不同的蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合是不同的，故該法適合測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相近的蛋白質(zhì)。器材吸量管； 試管；721型分光光度計試劑1. 標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液：配成ml的溶液。2. 待測蛋白質(zhì)溶液。3. 染料溶液：稱取考馬斯亮藍 G-250 溶于95%勺酒精50ml,再加入85%勺濃磷酸100ml, 用水稀釋至1000ml,混勻備用。操作步驟1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:調(diào)零,測定各管吸光度值(A)。以吸光度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 樣品測定：取1ml樣品溶液（約含25250微克蛋白質(zhì)），加入染料溶液5ml混勻，5min后測定其595nm吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)濃度。、雙縮脲

3、（Biuret）法測定蛋白質(zhì)含量實驗原理在堿性溶液中，雙縮脲（H2N-CO-NH-CO-NH與二價銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含二個或二個以上酰胺基（一CO-NH!，或與此相似的基團如CH-NH2, CS-NH, C（NH）NH的任何化合物，無論這類基團直接相連還是通過一個碳或 氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵（CO-NH-），可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且呈色強度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。測定范圍為 110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，

4、 不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。 主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。試劑1. 雙縮脲試劑： 取CuSQ5H0.）和酒石酸鉀鈉.）以少量蒸餾水溶解， 再加/ L NaOH 溶液300ml, KI ，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。長期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不能使用。2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10g/L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用 BSA濃度1g/L的A280為來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可 預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)

5、溶液。牛血清清蛋白用或NaCI配制，酪蛋白用 L NaOH配制。器材1 .試管：15 x 150mm試管7只；2. 1ml, 5ml 移液管；3 .坐標(biāo)紙;4. 721分光光度計。操作步驟取試管7支，編號，按下表操作：試劑管號空白管12345測定管蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（10g/L ）-生理鹽水待測樣品-雙縮脲試劑相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)（g/L ）01020304050混勻，37C水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計波長540nm處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度值。15為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測定管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得蛋白質(zhì)濃度。注意事項1. 雙縮脲試

6、劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2+形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止 CuSO 5Hz0不穩(wěn)定形成Cu（OH）2沉淀。酒石酸鉀鈉與 CuSO5f0之比不低于3 : 1，加入KI作為抗氧化 試劑。2 雙縮脲試劑要封閉貯存，防止吸收空氣中的二氧化碳。3 本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點是靈敏度較低。4 黃疸血清、嚴(yán)重溶血對本法有明顯干擾。思考題1 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的原理是什么？其它還有什么方法測定蛋白質(zhì)的含量？2 .請用雙縮脲法，設(shè)計一個測定蛋白質(zhì)含量的定量方法（除標(biāo)準(zhǔn)曲線法外）。三、酚試劑法測定血清蛋白質(zhì)含量（改良Lowry法）實驗原理蛋白質(zhì)分子中所含肽鍵在堿性條件

7、下與銅絡(luò)合生成復(fù)合物產(chǎn)生紫紅色化合物（雙縮脲反應(yīng)），同時使肽鏈展開，蛋白質(zhì)中半胱氨酸、絡(luò)氨酸、色氨酸和組氨酸均能使鎢酸、鉬酸同 時失去1個，2個或者3個氧原子，還原成多種還原型的混合酸，并且有特殊的藍顏色（最 大吸收峰波長為745750n m,反應(yīng)式一）其藍色深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)成正比，由 此可測出樣品中蛋白質(zhì)的含量。同時蛋白質(zhì)肽鍵發(fā)生烯醇化反應(yīng)（反應(yīng)式二）能使鉬離子在pH10時螯合在肽結(jié)構(gòu)中，形成復(fù)合物，從而使電子轉(zhuǎn)移到混合酸的顯色劑上，大大增加了 酚試劑對蛋白質(zhì)的敏感性。反應(yīng)式一3H2OPQ?13WOP5MoO?10H2O3HORQ?14WO?4MoO? 10"O3H20

8、P2Q?14WO?4Mo(2P 10H2O烯醇化反應(yīng)烯醇化反應(yīng)后，可與 Cu2+絡(luò)合，絡(luò)合后，易于使肽釋放電子，使酚試劑還原。試劑器材1 .堿性銅試劑：甲液：稱取無水碳酸鈉，溶于L NaOH溶液100ml中。乙液：取硫酸銅(CuSQ ?5H2O )，溶于1%酉石酸鉀溶液100ml中。臨用前取甲液50ml，乙液1ml混合，即為堿性銅試劑。此液需現(xiàn)用現(xiàn)配。2 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(250 g/ml ):精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白25mg溶于%NaCl溶液中，以容量瓶定容至100ml。3 .樣品：取血清，置于 50ml容量瓶中，用NaCI溶液稀釋至刻度處，混勻，為待測 血清樣品。4. 酚試劑：取鎢酸鈉(N

9、aW0P2HzO) 100g和鉬酸鈉(NqMoQ?2H2O) 25g,溶于700ml蒸餾水中，再加入85%磷酸50ml和濃硫酸100ml充分混勻，置于1500ml圓底燒瓶中溫和地回 流10小時，冷卻，取下冷凝裝置，再加入硫酸鋰(Li 2SQ?2H2O) 150g,水50ml,溴34滴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，驅(qū)除過量的溴，冷卻后稀釋至1000ml，過濾，溶液應(yīng)呈黃色或金黃色(如帶綠色不能使用，應(yīng)繼續(xù)加溴煮沸)，置于棕色瓶中保存。 使用前，以酚酞為指示劑，用LNaOF溶液滴定，求出酚試劑的摩爾濃度。然后根據(jù)此濃度，將酚試劑用蒸餾水稀釋至最 后酸度為1mol/L。(滴定時可將酚試劑稀釋，以免顏色影響

10、)。試劑放置過久，變成綠色 時，可再加溴數(shù)滴煮 15分鐘，如能恢復(fù)原有的金黃色仍可使用。5. 721分光光度計；旋渦混合器；秒表；試管。操作步驟取試管7支，編號，按下表操作:試劑(ml)管號O12345測定管標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(250 卩 g/ml )一一稀釋血清一一一一一一%NaCl堿性銅試劑混勻，室溫放置20mi n酚試劑混勻，室溫放置 30min 后，以 0 管調(diào)零點，在波長 650nm 比色，分別讀取各管吸光度值。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測定管吸光度值，查 標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血清蛋白質(zhì)含量。 臨床意義 1. 血清總蛋白濃度增高：（ 1）血清中水分減少，而使蛋白濃度相

11、對增高。如急性失水時（嘔吐、腹瀉、高熱）； 休克時，由于毛細管通透性的變化，血漿也發(fā)生濃縮等。（ 2）蛋白合成增加，大多數(shù)發(fā)生多發(fā)性骨髓瘤患者中，主要是血清球蛋白增加。2血清蛋白合成降低：（1）合成障礙，主要為肝功能障礙，肝臟是合成蛋白質(zhì)的場所，肝功嚴(yán)重損害時，蛋 白質(zhì)的合成減少，以白蛋白最為顯著。（2）蛋白質(zhì)丟失，如嚴(yán)重灼傷時，大量血漿滲出；腎病綜合癥時，尿液中長期丟失蛋 白質(zhì)等。（3）營養(yǎng)不良或長期消耗性疾病，如嚴(yán)重結(jié)核或長期消耗性疾病。（ 4）血液中水分增加， 血漿被稀釋， 因各種原因引起的水鈉潴留或輸注過多低滲溶液。 注意事項 1. 酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性銅試劑是在堿性條件下

12、與蛋白質(zhì)相互作用，所 以當(dāng)加入酚試劑后，應(yīng)迅速搖勻（加一管搖一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸 - 磷鎢酸試劑 被破壞之前。2. 堿性銅試劑必須臨用前配制。3. 磷鉬酸、 磷鎢酸的顯色反應(yīng)是由于和還原物質(zhì)的還原反應(yīng)而引起的， 因此本法可受很 多還原性物質(zhì)的干擾，如帶有 -SH 的化合物，糖類、酚類等甚至有些緩沖劑（如 Tris ）也能 干擾測定。但如控制在低濃度范圍內(nèi)，則不影響測定，Lowry法很靈敏，可以對 5100卩g蛋白質(zhì)樣品進行很好的顯色反應(yīng)， 而如此低的蛋白質(zhì)濃度常常已把干擾物質(zhì)的濃度稀釋到一 個不起作用的水平。4. 所有器材必須清洗干凈，否則影響實驗結(jié)果。5. 血清稀釋的倍數(shù)應(yīng)使蛋白質(zhì)

13、含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)， 若超過此范圍需要將血清酌情稀 釋。6. 本法操作簡便、靈敏度高，缺點是試劑只與蛋白質(zhì)中半胱氨酸、色氨酸等起反應(yīng)， 因此可因各種蛋白質(zhì)中含這幾種氨基酸的量不同使顯色強度稍有不同。 思考題 1. 用酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量有哪些優(yōu)點？2. 用酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量有哪些干擾作用？應(yīng)如何注意？四、紫外吸收法實驗原理蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。 此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正

14、比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的 （NH） 2SQ等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)， 會出現(xiàn)較大的干擾。 核酸的干擾可以通過查校正表， 再進行計算的方 法，加以適當(dāng)?shù)男?/p>

15、正。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的 pH相一致。試劑器材1.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）：準(zhǔn)確稱量經(jīng)微量凱氏定氮法校正的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)配制。2 紫外分光光度計。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取8支試管，按下表編號并加入試劑：試劑（ml） 官號01234567蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml） 蒸餾水00混勻。在280nm處測定各管溶液的吸光度值。以0號管調(diào)零，以蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

16、曲線。2. 蛋白質(zhì)樣品溶液，在 280nm處測得吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。注意事項1. 蛋白質(zhì)的最高吸收峰可因 pH的改變而發(fā)生變化，因此要注意保持待測蛋白質(zhì)溶液的 pH值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液一致。2. 測定液必須澄清，以免造成結(jié)果誤差。3 .本法需用石英比色杯。思考題1為什么紫外吸收法可作為蛋白質(zhì)定量測定方法？其理論依據(jù)是什么？ 2此法測定蛋白質(zhì)具有什么特點？實驗二十一 紫外光吸收法測定蛋白質(zhì) 濃度目的和要求了解紫外吸收法測定蛋白質(zhì)濃度的原理。熟悉紫外分光光度計的使用。原理蛋白質(zhì)組成中長含有酪蛋白和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光 280nm 波長處有最大吸收峰，一定濃度范圍內(nèi)其濃度與吸光

17、度成正比，故可用 紫外分光光度計通過比色來測定蛋白質(zhì)的含量。由于核酸在280nm波長處也有光吸收，對蛋白質(zhì)測定有一定的干擾作用， 但核酸的最大吸收峰在 260nm 處。如同時測定 260nm 的光吸收，通過計 算可以消除其對蛋白質(zhì)測定的影響。 因此如溶中存在核酸時必須同時測 定280nm及260nm的吸光度，方可通過計算測得溶液中的蛋白質(zhì)濃度。操作步驟一. 直接測定法在紫外分光光度計上，將未知的蛋白質(zhì)溶液小心盛于石英比色皿中，以生理鹽水為對照，測得280nm和260nm兩種波長的吸光度（A280nm及A260nm)將A280nm及A260nm波長處測得的吸光度按下列公式計算蛋白質(zhì)濃度。C =式

18、中C蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/ml）；A280nm蛋白質(zhì)溶液在280nm處測得的吸光度；A260nm蛋白質(zhì)溶液在260nm處測得的吸光本法對微量蛋白質(zhì)的測定既快又方便，它還適用于硫酸銨或其他鹽類混 雜的情況，這時用其他方法測定往往較困難。為方便起見對于混合蛋白質(zhì)溶液，可用A280nm乘以來代表其中蛋白質(zhì)的大致含量（mg/ml ）。（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取8支干凈試管，編號，按下表加入試劑。管號01234567試劑1mg/ml卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)0液/ml蒸餾水/ml蛋白濃度/ (mg/ml)A280nm加畢，用紫外分光光度計測 A280nm以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為 橫坐標(biāo)作圖。樣液測定取未知濃度的蛋白液，加蒸餾水 ml，測A280nm對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋 白質(zhì)濃度。試劑和器材一、試劑1. 卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：約1g卵清蛋白溶于NaC溶液，離心，取上清液,