實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作要求規(guī)范及注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)根本操作標(biāo)準(zhǔn)及考前須知一、酶與載體的分裝酶類與載體：T載體(50ng/叱1)用滅菌水稀釋4倍(12.5ng/仙l)后分裝成10(11或20n1;連接酶(solutionI)按5111分裝；dNTP(10mM分裝成50履；無菌水分裝成1ml；注意：(1)所有分裝都必須用已滅菌的管.(2)所有工具酶和載體的使用過程均在冰浴中進(jìn)行.(3)工具酶、載體以及試劑盒等實(shí)驗(yàn)室共用物品,用完后必須及時(shí)放回原處,以免耽誤他人使用.(4)當(dāng)你發(fā)現(xiàn)你使用的是最后一管(盒)公用物品時(shí),請(qǐng)馬上告知負(fù)責(zé)人購(gòu)置,以免耽誤使用.(5)感受態(tài),氨葦青霉素和IPTG由研究生輪流負(fù)責(zé)制備.每人負(fù)責(zé)六個(gè)月.其他試

2、劑那么由第一位使用新包裝的同學(xué)分裝.由于分子實(shí)驗(yàn)工具酶比擬容易失活,必須在冰上進(jìn)行分裝.二、常見抗生素及IPTG的配置以氨葦青霉素為例：1 .準(zhǔn)備足夠量的1.5ml的EP管、兩個(gè)100ml的離心管、0.22仙m水系濾器、注射器、蒸儲(chǔ)水,以上用品均要進(jìn)行高壓滅菌.2 .潔凈工作臺(tái)紫外滅菌,然后進(jìn)行以下操作.3 .稱取2g的氨葦青霉素粉末于離心管中,參加滅菌水至總體積為20ml,輕搖離心管,至氨葦青霉素粉末完全溶解,以免過濾時(shí)堵塞濾膜.4 .用注射器吸取配制好的溶液,然后把濾器安在注射器上,緩緩?fù)苿?dòng)注射器活塞,把溶液經(jīng)濾膜推至100ml的離心管中.注意：動(dòng)作要緩和,使濾出液出口正對(duì)著離心管,還要預(yù)

3、防染菌.5 .把100ml離心管中已除菌的氨葦青霉素溶液分裝到1.5ml的EP管中,每管0.5ml0在EP管上做好標(biāo)記,包括名稱、濃度、日期等.6 .把做好標(biāo)記的盛有氨葦青霉素的EP管于-20C保存.注意：當(dāng)你發(fā)現(xiàn)你使用的是最后一管抗生素時(shí),請(qǐng)馬上告知有關(guān)人員及時(shí)配制,以免耽誤使用.表1.常見抗生素的儲(chǔ)存濃度及工作濃度名稱儲(chǔ)存濃度工作濃度氨卜青霉素(ampicillin)100mg/ml50心g/ml100心g/ml卡那霉素(kanamycin)10mg/ml10心g/ml50心g/ml氯霉素(chloramphenicol)25mg/ml12.5心g/ml25心g/ml鏈霉素(strepto

4、mycin)50mg/ml10心g/ml50心g/ml四環(huán)素(tetracyyline)10mg/ml10心g/ml50心g/mlIPTG1M0.05-0.6mM三、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種試劑與溶液的配制分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種試劑與溶液的配制參見?分子克隆?四、總DNA勺提取具體步驟參測(cè)試劑盒說明書.注意：革蘭氏陽(yáng)性菌DNAI取時(shí)需要加溶菌酶五、基因擴(kuò)增1 .引物與合成：設(shè)計(jì)引物序列,發(fā)至生工公司進(jìn)行合成jinansangon.2 .引物配制：合成后的引物先離心至管底,然后按說明書用無菌水稀釋至10-50pM,分裝至無菌EP管中,做好標(biāo)記一定要標(biāo)記濃度！后,于-20度保存?zhèn)溆?3 .PCR反響體系

5、配制：將所需各組分在冰浴中化開后,進(jìn)行PC網(wǎng)應(yīng)體系配制.反響體系及反響參數(shù)按不同聚合酶的說明書進(jìn)行,以transgen的easyTaq酶擴(kuò)增1kb基因序列為例,100口反響體系為：10xbuffer10口,dNTP10mM2,引物各2口10-50仙M,模板1口根據(jù)濃度加減體積,Taq酶1小,ddHO82口注意：參加順序?yàn)椋核?buffer,dNTP引物,模板,酶.渦旋混勻,分裝至四-五管,瞬時(shí)離心.注意：假設(shè)反響時(shí)間較長(zhǎng)在反響混合液的上層加10-20履的礦物油防止樣品在PCR勺過程中蒸發(fā).4 .將管放入PCRZ中,在PCRCZ上設(shè)置好PC阪應(yīng)參數(shù),例如：94C5min,94C40sec,Tm5

6、5c1min,72C2min,72C10min,16C1h,一般設(shè)30個(gè)循環(huán).待溫度降至16C后停止PCRZ,盡快取出樣品,不允許過夜.六、瓊脂糖核酸電泳1 .電泳緩沖液的配制：電泳緩沖液一般為TAE或TBE,其配制方法參見表2,先配制50X母液放于4度冰箱中,電泳時(shí)稀釋100倍使用.2 .將制膠模具和梳子沖洗干凈,架好梳子；3 .根據(jù)欲別離DNAt段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠表3:準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉,參加到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi),定量參加電泳緩沖液；4 .放入到微波爐內(nèi)加熱至膠粒全部熔化一般沸三次即好,冷卻片刻,倒入制膠模具中,待其凝固；a室溫下30-45分鐘后凝膠完全凝結(jié),小心拔

7、出梳子,將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；b向電泳槽中倒入電泳緩沖液,其量以沒過膠面1mW宜,如樣品孔內(nèi)有氣泡,應(yīng)設(shè)法除去；c在DNA羊品中參加1/5-1/10體積的上樣緩沖液1%SDS,50附油,0.05%溟酚藍(lán),混勻后,用槍將樣品混合液緩慢參加被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi)；5 .接通電源,紅色為正極,黑色為負(fù)極,切記DNA羊品由負(fù)極往正極泳動(dòng)靠近加樣孔的一端為負(fù).根據(jù)膠的長(zhǎng)度設(shè)定電壓,一般5-8V/cm,電泳20-40min,澳酚藍(lán)跑完膠板的3/4左右即可；6 .電泳完畢,關(guān)上電源,戴上手套,將膠放入0.5ig/ml的澳化乙錠EB溶液中,室溫下染色5-10min.7 .蒸儲(chǔ)水中漂洗一下,置于紫外燈下或凝膠成像

8、儀上觀察電泳帶及其位置,并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比擬被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小.如果要切膠回收,最好在觀察臺(tái)上鋪上塑料片觀察,預(yù)防污染以及紫外燈引起DNAASE.注意：澳化乙錠EB有劇毒,操作時(shí)應(yīng)注意平安,戴手套操作.但是要預(yù)防污染染色池和切膠板以外的區(qū)域.操作完后手套和膠分別放入垃圾桶和回收桶.表2.電泳緩沖液TAE配方電泳緩沖液配方緩沖液使用液濃貯存液每升Tris-乙酸(TAE)0.5x:0.02mol/LTris-乙酸50X：242gTris堿0.0005mol/LEDTA57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)表3.瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最正確分辨范圍瓊脂糖

9、凝膠濃度與線形DNA瓊脂糖凝膠濃度DNA的最正確分到W也圍bp0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000七、回收與連接1 .將切下的目的條帶根據(jù)回收試劑盒說明書進(jìn)行產(chǎn)物回收；2 .連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度.稀釋好的T載體濃度為12.5ng/仙l,不用再確定濃度,每次用量為1回.3 .連接反響體系的配制1用SolutionI連接時(shí),取一只分裝的SolutionI離心管含5仙lSolutionI,參加待連接的兩個(gè)DNA樣品：載體與片段載體與片段的mol比為1:3-5,加水補(bǔ)足

10、102用T4連接酶5回連接時(shí),取一只滅菌PCRt,參加10X連接buffer1回,待連接的兩個(gè)DNA羊品：載體與片段載體與片段的mol比為1:3-5,T4連接酶1,加水補(bǔ)足10回.3連接至T載體時(shí)反響體系一般為：回收的PCRT物4l,solutionI5膜,4倍稀釋的pMD-18Ts隆載體12.5ng/小1回.注意：參加順序?yàn)椋核?buffer,DNA羊品,酶4 .混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底.5 .將離心管置于16C孵育4h以上或過夜.八、E.coliDH5a和B121感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaC12制備法制備E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞,步驟如下：1 .準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)：1準(zhǔn)備LB固體培養(yǎng)

11、基和分裝于試管2-5ml和三角瓶100ml的液體培養(yǎng)基.2分別配制含15%T油的和不含甘油的0.1MCaC12.3準(zhǔn)備干凈培養(yǎng)皿、非常干凈的100ml離心管2只,1.5mlEP管50只,1ml和200壯槍尖各一盒.4將以上培養(yǎng)基和物品高壓滅菌.2 .在LB平板上活化E.coliDH5a.將活化的E.coliDH5a單菌落接種于成含LB培養(yǎng)基的試管中,37c搖床過夜培養(yǎng).3 .第二天按1%8種量接種到含100mlLB培養(yǎng)基的三角瓶中,37c搖床培養(yǎng)至.展0=0.4-0.6約2h04 .冰浴10min,倒入滅過菌的100ml離心管中離心,4000rpm,10min,4C.5 .去掉上清,加20ml

12、配制好的已滅菌的0.1MCaCl2,將菌體打散后靜置20min,4000rpm離心10min,去掉上清.6,加1-2ml滅菌的0.1MCaCl2含15%T油制成感受態(tài)細(xì)胞.將制好的感受態(tài)細(xì)胞分裝成50履小份保存于-80C冰箱.7.E.coliBl21和BL21DE3的制備方法同上.注意：1所有操作均在冰上進(jìn)行；2整個(gè)制備過程必須保證無菌操作；3E.coliBl21,BL21DE3,DH5a菌種每學(xué)期更換一次.九、轉(zhuǎn)化1,取50/感受態(tài)細(xì)胞于冰浴上融化.2.參加10/連接產(chǎn)物或3-5/純質(zhì)粒,輕輕吹打混勻,冰浴20min.3,放入42C水浴中熱激90秒,立即放入冰浴中2-10min.4,參加0.

13、5ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基,于37C培養(yǎng)1h.5,將培養(yǎng)物4000rpm離心3min,保存約200/上清于1沖,將菌體用無菌槍尖輕輕打散,均勻涂布于含100pg/mlAmp+的平板外表,平板于37c先正置1-2h,后倒置培養(yǎng)12-16h至菌落出現(xiàn).十、重組子的篩選和鑒定從轉(zhuǎn)化平板上挑取白色菌落,轉(zhuǎn)接至含抗生素Amp100pg/ml的LB液體培養(yǎng)基,37c振蕩培養(yǎng)過夜.菌液可以用以下三種方法驗(yàn)證是否是陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子.注意：同時(shí)培養(yǎng)陰性菌落作為對(duì)照！一酚抽驗(yàn)證取1ml菌液12,000rpm離心1min收集菌體,盡量倒干凈上清后參加50/Tris飽和酚和50口水,漩渦震蕩5min充分混勻.12,0

14、00rpm離心10min后迅速取上清進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳.二質(zhì)粒酶切驗(yàn)證1,根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取,用未插入片段的質(zhì)粒作為陰性對(duì)照,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳.電泳后可根據(jù)質(zhì)粒的大小初步判斷質(zhì)粒中是否有插入片段,并推測(cè)質(zhì)粒的濃度.2 .利用引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)或質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn),對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切.根據(jù)待切質(zhì)粒的濃度確定要加的體積,選擇適宜的限制性內(nèi)切酶和配套Buffer.3 .在離心管中參加如下成分：10XBuffer2/待切樣品x/一M為5川左右酶1/10UU加滅菌水補(bǔ)足20/酶的多少并不是一成不變的,關(guān)鍵要看待切DNA的濃度,如果濃度較低,可以適當(dāng)少加酶.不要在20M體系中參加超過2的酶,那樣容易產(chǎn)生星號(hào)活性.4、混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底.5、將離心管置于37c中溫育2h,假設(shè)待切樣品為PCFT物,那么可將反響時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng).最長(zhǎng)酶切時(shí)間要取決于是否會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活性.如果50M體系參加1回酶,那么可過夜酶切一般不會(huì)出現(xiàn)星號(hào)活性.6、用未酶切的質(zhì)粒作為對(duì)照,瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果.注意：當(dāng)酶切樣品用于回收而不是鑒定時(shí),可按