泛素蛋白酶體及其抑制劑

1、泛素-蛋白酶體及其抑制劑沈子珒 許嘯聲 李稻審校上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室摘要：蛋白酶體與泛素化信號(hào)系統(tǒng)一起構(gòu)成的泛素蛋白酶體（UPP）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白水解酶體系，參與和調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。蛋白酶體是一個(gè)由20S催化顆粒、11S調(diào)控因子和2個(gè)19S調(diào)節(jié)顆粒組成的ATP依賴性蛋白水解酶復(fù)合體。蛋白酶體的活性狀態(tài)對(duì)細(xì)胞功能正常維持是非常重要的。26S蛋白酶體對(duì)蛋白的降解依賴于靶蛋白的泛素化和泛素化蛋白識(shí)別。蛋白酶體抑制劑能通過(guò)抑制蛋白酶體活性進(jìn)而干擾和影響細(xì)胞原有的功能，尤其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。同時(shí)，利用蛋白酶體抑制劑改變蛋白酶體的酶切位點(diǎn)活性也成為免疫、炎

2、癥等研究的熱點(diǎn)。蛋白酶體的抑制劑可分為天然化合物和合成化合物兩類，其中Bonezomib（Velcade，PS-341）是近年研究較多的一種蛋白酶體抑制劑。關(guān)鍵詞：腫瘤 蛋白酶體 泛素 蛋白酶體抑制劑 PS-341泛素蛋白酶體通路（Ubiquitinproteasome pathway，UPP）的蛋白酶體（proteasome）是一種具有多個(gè)亞單位組成的蛋白酶復(fù)合體，蛋白酶體沉降系數(shù)為26S，故又稱26S蛋白酶體。蛋白酶體水解蛋白的前提是靶蛋白的泛素化。在UPP中，各種靶蛋白質(zhì)泛素化后，先被26S蛋白酶體的19S亞單位識(shí)別，隨后泛素化靶蛋白脫泛素鏈和變性，進(jìn)入20S亞單位的筒狀結(jié)構(gòu)內(nèi)被降解成3

3、22個(gè)多肽。由于蛋白酶體具有精確降解細(xì)胞內(nèi)各種目的靶蛋白，進(jìn)而參與基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，以及受體胞吞、抗原呈遞等各種細(xì)胞生理過(guò)程 1。因此，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑改變其酶切位點(diǎn)活性已成為抗腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，蛋白酶體是影響和改變細(xì)胞功能重要的目的靶標(biāo)。1蛋白酶體組成1979年，Goldberg等首先報(bào)道在大鼠肝臟和網(wǎng)織紅細(xì)胞中存在一種分子質(zhì)量為700 kD的受ATP激活的中性蛋白水解酶。此后，一些在形態(tài)、功能及免疫學(xué)特征上與之相同的顆粒通過(guò)不同途徑被分離出來(lái)，被統(tǒng)一命名為蛋白酶體2。在真核生物進(jìn)化中，蛋白酶體具有高度的保守性，其簡(jiǎn)單形式甚至存在于古細(xì)菌和真細(xì)菌中。真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體分布于胞質(zhì)與

4、胞核內(nèi)，有的與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞骨架相結(jié)合，約占細(xì)胞蛋白質(zhì)總量的1。有功能的26S蛋白酶體是由20S催化顆粒（catalytic particle, CP）、11S調(diào)控因子（11S regulator）和2個(gè)19S調(diào)節(jié)顆粒（regulatory particle, RP）組成，其分子量為2.4MD，是ATP依賴性蛋白水解酶復(fù)合體。1120S催化顆粒（20S CP） 人類蛋白酶體CP的沉降系數(shù)為20S，分子量700750kD。它由環(huán)和環(huán)組成，每個(gè)環(huán)各有7個(gè)相同的亞單位，分別以1-71-71-71-7順序排列成圓桶狀結(jié)構(gòu)，20S CP中間由兩個(gè)亞單位環(huán)組成。幾乎所有亞單位都含有一個(gè)N 端前導(dǎo)序列，盡管此

5、序列在20S CP裝配過(guò)程中被切除，但在引導(dǎo)真核生物亞單位的正確折疊以及與亞單位的組裝中有重要作用3。當(dāng)亞單位的N端前導(dǎo)序列被切除后，Thr殘基被暴露出來(lái)，Thr是酶的活性位點(diǎn)，分別存在于環(huán)的內(nèi)表面，使亞單位具有類似的絲氨酸蛋白酶的催化作用4。例如，亞單位N端的折疊方式允許Thr的-OH對(duì)底物發(fā)動(dòng)親核反應(yīng)形成半縮醛，而Thr的-NH3可代替絲氨酸蛋白酶中His的咪唑基作為質(zhì)子受體。此外，活性位點(diǎn)附近的一個(gè)Lys殘基與特定的絲氨酸蛋白酶中一樣，也起著催化劑的作用。目前認(rèn)為，在20S CP內(nèi)起催化作用的亞單位主要是b1、b2、b5。不同的亞單位的催化活性盡管不同，但能互相協(xié)調(diào)使蛋白酶體具有多種蛋白

6、酶活性，如類糜蛋白酶活性(chymotrypsin-like, ChTL)、類胰蛋白酶活性（trypsin-like，TL）、肽-谷氨酰肽水解酶活性（post-glutamyl-peptide hydrolyzing，PGPH）、支鏈氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性。在20S CP圓桶狀的兩端由亞單位環(huán)組形成，環(huán)口的中央被亞單位(1、2、3、6、7)的N末端肽鏈所占據(jù)，使環(huán)的外側(cè)完全關(guān)閉，阻止胞內(nèi)非目的靶蛋白質(zhì)進(jìn)入20S CP內(nèi)，而遭到降解破壞。不論在種間或種內(nèi)，類亞單位遺傳特征均比類亞單位更為保守。1211S調(diào)控因子 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在參與調(diào)控蛋白酶體功能的復(fù)合物，11S調(diào)控因子（REG

7、或PA28）是其中之一。11S調(diào)控因子的亞單位分子量為28KD，其亞單位分為：ERGa、ERGb、ERGg（Ki抗原）三種。亞單位的氨基酸序列大部分具有同源性，但17-34殘基為易變區(qū)，這也賦予亞單位的特異性。ERGa和ERGb可優(yōu)先形成一個(gè)七瓣形調(diào)控復(fù)合物11S調(diào)控因子5，并結(jié)合到20S CP末端，而ERGg不能與ERGa和ERGb結(jié)合形成11S調(diào)控因子。11S調(diào)控因子本身不具有催化和降解大分子蛋白的功能，但可激活蛋白酶體的蛋白酶活性，以及在促進(jìn)抗原肽產(chǎn)生中起到重要的作用5。Wilk等人認(rèn)為，ERGb低聚合體對(duì)蛋白酶體的活性有激活作用，而單體時(shí)卻是蛋白酶體的強(qiáng)有力抑制物6。1319S調(diào)節(jié)顆粒

8、（19S RP） 19S RP（19S調(diào)節(jié)復(fù)合物、19S帽或PA700）分別由20個(gè)亞單位組成，分子量為700KD，位于20S CP的兩端。從酵母到人類，19S RP的多數(shù)亞單位具有高度的保守性。19S RP形成蓋部 (1id)和基底部(base) 兩個(gè)亞復(fù)合體。19S RP基底部含有三倍體ATP酶亞基（RP triple ATPase, Rpt）和非ATP酶亞基（RP non- ATPase, Rpn），分子量在30110kD之間 7。6個(gè)Rpt亞基和2個(gè)Rpn亞基（Rpnl和Rpn2）組成的基底部位于CP的兩側(cè)， 6個(gè)Rpt亞基直接與20SCP的7個(gè)亞基結(jié)合在一起共同構(gòu)成蛋白酶體。另外，R

9、pt有兩個(gè)有特殊作用：Rpt2 ATP酶參與打開(kāi)環(huán)孔道；Rpt5 ATP酶參與識(shí)別泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，這有利于引導(dǎo)展開(kāi)的泛素化蛋白進(jìn)入20SCP的環(huán)內(nèi)。Strous等人認(rèn)為，19S RP基底部能單獨(dú)降解小分子多肽和非泛素化蛋白，蓋部對(duì)蛋白酶體水解泛素化蛋白提供了高度的特異性保證8。另外，Romagnani等人研究發(fā)現(xiàn)，在Rpnl0或Rpn9基因缺失、突變的酵母株中，蓋部與基底部易發(fā)生脫落。這提示Rpn9和Rpnl0可能具有“合頁(yè)”樣的接納體(acceptor)作用8。所以，完整的26S蛋白酶體對(duì)ATP依賴的泛素化蛋白降解是必須的。 2泛素化靶蛋白識(shí)別靶蛋白（斷裂、氧化或衰老等引起的蛋白質(zhì)損傷）的

10、泛素化是26S蛋白酶體降解蛋白的前提。但如何識(shí)別目的靶蛋白？目前為止，還知之甚少。但有人認(rèn)為，在靶蛋白的泛素化過(guò)程中，對(duì)蛋白質(zhì)F-box序列的識(shí)別是識(shí)別已磷酸化靶蛋白的前提。F-box是蛋白質(zhì)間特異性相互作用的位點(diǎn)，具有F-box序列的蛋白質(zhì)能夠特異性結(jié)合磷酸化的蛋白，同時(shí)，也是泛素連接酶復(fù)合體的主要成分 9。21 靶蛋白泛素化90年代初，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面受體和配體結(jié)合引起的受體磷酸化與受體的泛素化降解過(guò)程密切相關(guān)10。許多細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的泛素化受其自身磷酸化的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白激酶的抑制蛋白、參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的調(diào)控蛋白（表面受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），以及一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（b-連

11、環(huán)蛋白、P53、Jun、RNA聚合酶等）11。靶蛋白的泛素化過(guò)程受遺傳控制，許多蛋白都具有自身特定的泛素化所需的氨基酸序列。Varshavsky等人首先發(fā)現(xiàn)重組p一半乳糖苷酶N一端存在降解決定序列，其泛素化的速度極大程度上依賴于N一端殘基的同一性12。此后，發(fā)現(xiàn)一些與泛素化降解相關(guān)序列具有親水性特征。但是，蛋白酶體對(duì)蛋白水解也有例外，如腫瘤抑制基因的RB蛋白能與人巨細(xì)胞病毒pp71蛋白結(jié)合在一起可通過(guò)非泛素化途徑進(jìn)行蛋白酶體的蛋白水解13。22 靶蛋白脫泛素化 泛素化也是一個(gè)可逆的過(guò)程。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)存在多種脫泛素酶(DUB)，能夠水解泛素和蛋白質(zhì)間的硫酯鍵。DUB可分為兩類：一類是泛素羧

12、端水解酶，水解泛素C端的連接小肽，也參與由泛素前體產(chǎn)生泛素單體的過(guò)程；另一類是泛素特異性加工酶，參與去除泛素化蛋白上的多聚泛素鏈，從而防止泛素化蛋白蓄積13。當(dāng)?shù)鞍酌阁w功能受抑制時(shí)，泛素化蛋白水解減少，蓄積的泛素化蛋白可出現(xiàn)脫泛素，如泛素化c-JNK激酶水解減少時(shí)，蓄積的泛素化c-JNK激酶可過(guò)脫泛素途徑使c-JNK激酶復(fù)活，結(jié)果導(dǎo)致c-Jun的磷酸化增加，從而增加核轉(zhuǎn)錄因子AP-1的DNA結(jié)合活性，使Fas表達(dá)增加13。3蛋白酶體抑制劑由于蛋白酶體活性狀態(tài)對(duì)細(xì)胞執(zhí)行不同的功能是非常重要的，因此蛋白酶體將成為影響細(xì)胞功能的重要藥物靶標(biāo)，而其抑制劑有可能成為抗腫瘤的先導(dǎo)藥物14。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，惡性

13、增殖細(xì)胞對(duì)蛋白酶體阻斷的敏感性比非腫瘤細(xì)胞更為強(qiáng)烈，如乳胞素(Lactacystin)對(duì)正常的淋巴細(xì)胞無(wú)明顯的作用。Masdehors等人發(fā)現(xiàn)B- CLL細(xì)胞中，ChTL活性水平是正常淋巴細(xì)胞的三倍，其蛋白的泛素化水平也高于正常細(xì)胞4。蛋白酶體的抑制劑可分為天然化合物和合成化合物兩類。31 天然化合物 311 3,4-二氯異香豆素 (DCI)DCI是絲氨酸蛋白酶的不可逆抑制劑。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，DCI也能抑制20S CP幾種肽酶，如ChTL活性。由于DCI在抑制蛋白酶體的ChTL活性時(shí)，也能激活20S CP的酪蛋白酶活性和其他的肽酶活性，因此是一種選擇性較差的抑制劑15。312 乳胞素(Lactacy

14、stin)乳胞素是鏈霉菌屬的天然代謝物，是一種選擇性的20S CP抑制劑，具有抑制細(xì)胞周期和誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞分化的功能。乳胞素的活性位點(diǎn)可能涉及其內(nèi)酰胺環(huán)上的甲基和異丁基側(cè)鏈上的第二個(gè)羥基15。乳胞素及其活性中間體的-內(nèi)酯可選擇性和不可逆地結(jié)合于蛋白酶體的b5亞單位，從而抑制蛋白酶體多種肽酶活性，其中ChTL活性最先被抑制，TL和PGPH的活性抑制較慢，絲氨酸和酪氨酸蛋白酶活性則不受抑制。Qiao等人發(fā)現(xiàn)，乳胞素可以阻止動(dòng)物和人類的結(jié)腸腫瘤形成，并通過(guò)脫氧膽酸抑制p53降解，導(dǎo)致核內(nèi)p53積聚和相應(yīng)的促凋亡基因的表達(dá)16。313 Aclacinomycin Aclacinomycin是一種Akl

15、avinone化學(xué)結(jié)構(gòu)，抑制蛋白酶體的ChTL活性，對(duì)組織蛋白酶B無(wú)抑制效應(yīng)，能激活胰島素，但對(duì)calpain作用范圍較小14。314 EponemycinEponemycin能以共價(jià)鍵方式結(jié)合到20S CP的 b5、b5i 和b1i亞單位，選擇性抑制蛋白水解酶活性，進(jìn)而抑制ChTL活性。當(dāng)Eponemycin濃度上升到50 nmol/L，也不抑制其他蛋白酶（calpain、組織蛋白酶B、木瓜蛋白酶、胰島素、糜蛋白酶）的活性14。315 PR-39 PR-39是一種富含精氨酸/脯氨酸的多肽，它能可逆性與蛋白酶體的a7亞單位結(jié)合14。32 合成化合物 321 醛基肽醛基肽一類蛋白酶體抑制劑，其中

16、包括：MLN-519、MG-132、CEP- 1612、CVT-634等。多數(shù)醛基肽抑制劑可以抑制20S CP中ChTL活性，阻止蛋白酶體對(duì)泛素化蛋白的降解。隨后研究表明，此類蛋抑制劑的P2和P3位置均為疏水性氨基酸，如Ac-Leu- Leu-Nie-H和Z-Leu- Leu-Phe-H 。通過(guò)對(duì)Z-Leu-Leu -Xaa-H的研究表明，當(dāng)P1位置為L(zhǎng)eu或Phe（疏水性氨基酸殘基）時(shí)，其抑制活性最強(qiáng)。目前認(rèn)為，MG-132（Z-leu-leu-leu-CHO，三肽基乙醛）作為蛋白酶體ChTL活性的可逆性抑制劑，同樣也能抑制組織蛋白酶和calpains作用。 另外，Desai等人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)

17、，盡管MG132可以抑制喜樹堿誘導(dǎo)的拓?fù)洚悩?gòu)酶I的下調(diào)，但也能使腫瘤細(xì)胞對(duì)喜樹堿的敏感性增加17。He等人提出，MG132能通過(guò)上調(diào)胞膜死亡受體-5與腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)配體(tumor necrosis factor- related apoptosis- inducing ligand Apo2L- TRA IL)一起有效地促進(jìn)Bax（）腫瘤細(xì)胞的凋亡18。近來(lái)，在HCT116細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MG132可以使腫瘤細(xì)胞停滯于G2/M期，并以劑量依賴方式抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡19。MLN-519與b5亞基上Thr1的親核的Og反應(yīng)。CEP-1612（二肽基乙醛）以可逆性加合物方式與b亞

18、基上Thr1的親核Og反應(yīng)；同時(shí)，還具有抑制溶酶體和Ca2+依賴的蛋白酶活性。322 硼酸肽（二肽硼酸衍生物）硼酸肽是重要的蛋白酶體抑制劑。在體外細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明有較強(qiáng)的蛋白酶體抑制活性，還具有高度的酶選擇性。Bonezomib（Velcade，PS-341）是近年來(lái)研究較多的一種蛋白酶體抑制劑。Bonezomib作用于26S蛋白酶體的催化中心，與20SCP的亞單位環(huán)的Thr位點(diǎn)結(jié)合，能有效地抑制26S蛋白酶體的蛋白水解功能，阻斷UPP系統(tǒng)20。Bonezomib通過(guò)對(duì)20S CP亞單位不同位點(diǎn)結(jié)合，能選擇性地抑制一些特定蛋白的降解，使得細(xì)胞周期不能有序地進(jìn)行，細(xì)胞周期停止于G2/M期

19、，最終導(dǎo)致ADP-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase）降解、核的固縮、細(xì)胞凋亡。Bonezomib對(duì)蛋白酶體的抑制作用是可逆的，在經(jīng)過(guò)72小時(shí)處理后大多數(shù)蛋白酶體的活性都可以恢復(fù)正常。Bortezomib也是首個(gè)用于臨床研究的蛋白酶體抑制劑，在單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物時(shí)，顯現(xiàn)出優(yōu)越的抗腫瘤作用和用藥的安全性。最近美國(guó)食品及藥品管理局（FDA）已批準(zhǔn)Bortezomib用于治療耐藥的多發(fā)性骨髓瘤患者21、22。 2-aminobenzylstatine（硼酸衍生物）一個(gè)基于結(jié)構(gòu)優(yōu)化處理和改進(jìn)的蛋白酶體抑制劑。其中，NVP-AFB340的最具潛力靶點(diǎn)是ChTL，IC50值達(dá)

20、到7nmol/L。另外，NVP- AFD314等化合物也證實(shí)對(duì)PGPH和TL的活性有好的選擇性抑制，IC50值在小于20mmol/L14。323 其他Ritonavir（HIV-1蛋白酶抑制劑）通過(guò)與20S CP的b5、b5亞單位結(jié)合，抑制ChTL活性，是一種比較弱和低分子量抑制劑。乙烯砜三肽（三肽的乙烯砜部分）競(jìng)爭(zhēng)性抑制物，對(duì)20S蛋白酶體的不同b亞單位具有較強(qiáng)的和特異性抑制作用，但也抑制胞漿cysteine蛋白酶。此外，金雀異黃素在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)對(duì)蛋白酶體20S CP 的ChTL活性有抑制作用23。Koguchi等人發(fā)現(xiàn)TMC-95A及其異構(gòu)體（B、C、D）可以高選擇性的抑制蛋白酶體

21、，作用于20S CP的ChTL、TL和PGPH活性基團(tuán)24。除了蛋白酶體抑制劑具有抗癌作用外，可能在抗炎癥方面也顯示它的作用，因?yàn)樵S多炎癥介質(zhì)也受蛋白酶體降解的影響。因此，蛋白酶體將成為了藥物發(fā)展過(guò)程中一個(gè)很具有前景的藥物靶標(biāo)。參考文獻(xiàn)：1A Ciechanover, Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitinproteasome system and onto human diseases and drug targeting，Cell Death and D

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