第四章液相層析分離法

1、第四章 液相層析分離法19世紀(jì)中葉已有人做過這樣或那樣的色層分離實(shí)驗(yàn),但系統(tǒng)地研究和介紹色層分離法的,一般公認(rèn)最早的為波蘭植物學(xué)家M茨維特。層析法又稱色層法氣 - 液氣 液 色 層 分 離 法氣 -固氣 固 色 層 分 離 法氣 相 色 譜液 -液液 液 色 層 分 離 法液 -固液 固 色 層 分 離 法液 相 色 譜色 層 分 離 法按流動(dòng)相分類分 配 色 譜 法吸 附 色 譜 法 離 子 交 換 色 譜 法色 譜 法按原理分類紙色層：濾紙吸附的水作固定相，有機(jī)溶劑作流 動(dòng)相。薄層色譜：把吸附劑粉末舖成薄層作為固定相。本章僅討論紙色層、薄層色譜法。第一節(jié)、紙色層 微量操作技術(shù)，簡、分離效率

2、高、但分離速度慢、基本原理紙色層紙上萃取色譜，它和萃取一樣，它也是根據(jù)不同物質(zhì)在兩相間的分配比不同而進(jìn)行分離的（相當(dāng)于逆流萃?。?。1.層析缸 2.濾紙 3.原點(diǎn) 4.展開劑 5.前沿 6.7.斑點(diǎn)12345673xyRf的計(jì)算2. 比移值Rf組份分離后,它們?cè)跒V紙上的位置用比移值Rf表示.定義:xyRf的大小取決于溶質(zhì)在二相間的分配系數(shù)及濾紙的性質(zhì). 不同的組分具有不同的分配系數(shù), 因而也就有不同的Rf. 這就是定性的依據(jù).3. 影響Rf的因素(1). 欲分離物的本性:物質(zhì)在兩相的分配系數(shù),決定了它的Rf大小;(2). 層析溶劑:同一組分在不同溶劑中Rf不同。通常應(yīng)選這樣的層析劑，使溶質(zhì)的Rf

3、在0.05 0.85之間,不同組分的Rf差值0.05.(3). pH:影響它們的存在狀態(tài)(4). 濾紙:質(zhì)地均一、厚薄適當(dāng)、具有一定機(jī)械強(qiáng)度、不含雜質(zhì)(5). 溫度:在層析缸中用紅外燈照射。溫度會(huì)影響溶質(zhì)的分配系數(shù)及流動(dòng)相的擴(kuò)散速度。層析操作應(yīng)在恒溫下進(jìn)行，溫度不超過 0.5oC(6). 展開方式:展開方式不同,Rf也不同。下行法的Rf最大，上行法的Rf較小，環(huán)行法的 Rf也不大。 操作技術(shù)(1). 濾紙(擔(dān)體)濾紙的選擇 a. 要求濾紙質(zhì)地均勻、平整無折痕邊緣整齊 b. 要求濾紙的纖維松緊適宜 c. 濾紙的雜質(zhì)含量少層析濾紙的性能與規(guī)格 濾紙的處理 以0.1 0.4 mol/L HCl (或

4、 2 mol/L HAc)浸泡數(shù)小時(shí), 除去無機(jī)雜質(zhì)后, 取出用蒸餾水洗凈, 再將濾紙放在丙酮-乙醇( 1 : 1 )中浸泡 一周時(shí)間, 除去有機(jī)雜質(zhì), 再取出風(fēng)干備用.固定相 紙層析以吸著在纖維素上的水作固定相。反相紙層析用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。若分離芳香油等非極性物，以石蠟油、硅油作固定相。(2). 試樣A.試樣的溶解 盡量避免用水。一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最好采用與展開劑極性相似的溶劑。液體樣，直接點(diǎn)樣。點(diǎn)樣方法a先用鉛筆在距紙條一端2 3 cm處劃一條直線（起始線）并在線上隔一定距離劃一“x”號(hào)表示點(diǎn)樣位置；見下示意圖：b.點(diǎn)樣工具：微量注射器、毛細(xì)滴管（0.5 m

5、m) ；c.點(diǎn)樣方法：用點(diǎn)樣工具吸取試液輕輕與“x”號(hào)接觸，使點(diǎn)樣的斑點(diǎn)直徑為0.2 0.5 cm, 每次點(diǎn)樣2 20 l于濾紙上，以冷風(fēng)吹干；d. 干后，將紙的兩邊用線縫好，以圓筒形式置于層析缸中展開。C. 展開 展開劑v 展開劑的選擇： 欲分離物在兩相中的溶解度； 展開劑的極性 展開劑與欲分離物間應(yīng)無化學(xué)反應(yīng) 欲分離物在展開劑中的分配系數(shù)最好不受溫度的影響a. 欲分離物在兩相間的分配平衡瞬間達(dá)到v展開劑水飽和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁酮、丙酮、有機(jī)酸、有機(jī)堿，有時(shí)也加入一定比例的無機(jī)酸、無機(jī)堿、甲醇、乙醇等b.展層方法：展層前，層析缸與已點(diǎn)樣濾紙必須予先經(jīng)水蒸汽、溶劑蒸氣

6、飽和。方法：將溶劑和水置于分液漏斗中充分振蕩，分層后，將水層放入小燒杯內(nèi)，置于層析缸中平衡一段時(shí)間，使濾紙吸飽蒸汽，然后移去小燒杯，將溶劑倒入溶劑槽中，立即將點(diǎn)好樣的濾紙的一端浸入溶劑槽內(nèi)展層。 上行法將點(diǎn)有試樣的濾紙條的下端浸入溶劑（但不能浸沒點(diǎn)樣處）上端固定在層析缸的上部，保持垂直，將缸密閉，使溶劑沿下端上升而展層。待溶液上升到距離紙上端3 4 cm 時(shí)，將濾紙取出，用鉛筆在溶劑前沿處畫線作記號(hào)（見右圖）對(duì)于 Rf 十分接近的物質(zhì)可采取連續(xù)揮發(fā)的色譜法 紙條的上端暴露在層析缸外，以便令上升的溶劑揮發(fā)；b. 只要保持紙條下端與溶劑面接觸，溶劑便能不斷地上升而揮發(fā)，展層過程就自動(dòng)連續(xù)地進(jìn)行；c

7、. 若溶劑沸點(diǎn)100oC，則可在紙條暴露部分用紅外燈烘烤，促使溶劑揮發(fā)；d. 該法不能測(cè)量前沿，但可達(dá)分離的目的。b.下行法 溶劑自紙的上端向下降（借助于重力的作用），具有分離速度快及連續(xù)揮發(fā)色譜的優(yōu)點(diǎn)。玻片玻璃棒原點(diǎn)玻皿剪成鋸齒狀，便于溶劑滴下c.環(huán)行法 又叫徑向色譜法。這是一種既快又方便的方法。取一張圓形濾紙?jiān)谥睆降膬蛇吀鳟媰筛叫芯€，用剪刀沿這兩根線剪至圓心處，在紙的中央滴上試液，干后，將濾紙夾在兩個(gè)大小相同培養(yǎng)皿之間，使剪開的紙條的尾端浸入流動(dòng)相。d. 雙向展開法有時(shí)用一種溶劑不能將樣品中組份分開時(shí)，可以試用雙向展開法。該法是用正方形或長方形濾紙，在紙的一角上點(diǎn)樣，先用一種展開劑朝一個(gè)

8、方向展開，展開完畢，待溶劑揮發(fā)后，再用另一種展開劑朝與原來垂直的方向進(jìn)行第二次展層。若前后二次展開劑選擇適當(dāng)，可使各種組份完全分離。例如，氨基酸的分離可用此法。雙向展開法也可以二次使用同一種展開劑展層。D. 顯色展層后，將濾紙從層析缸中取出，用鉛筆在溶劑前沿作記號(hào)a. 有色物：直接觀察各個(gè)色斑 無色物： 物理法顯色：用紫外燈照，觀察有無吸收或發(fā)出各種不同顏色的熒光斑點(diǎn)，并用鉛筆畫下斑點(diǎn)的位置及大小。. 分析a. 定性：各物質(zhì)有各物質(zhì)的Rf。為了查明未知物的組成，最好是在同樣條件下與已知的純物質(zhì)做對(duì)照實(shí)驗(yàn)化學(xué)法顯色：利用各種物質(zhì)的特性反應(yīng)，噴灑適當(dāng)?shù)娘@色劑，若被分離的物質(zhì)含有羧酸，可噴酸堿指示劑

9、溴甲酚綠，當(dāng)斑點(diǎn)呈黃色，說明羧酸確實(shí)存在；若被分離的物質(zhì)含有氨基酸，則可噴茚三酮，多數(shù)氨基酸呈紫色，個(gè)別氨基酸呈黃色。其它化合物所用顯色劑可從手冊(cè)里查閱。xyRf 的計(jì)算:Rf= x / yx1x2yRf的計(jì)算:Rf 1= x1 / yRf2 = x2 / y這樣每一個(gè)斑點(diǎn)用兩個(gè)Rf 來描述 定量 剪洗法：將斑點(diǎn)剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵?，然后用各種儀器方法（如紅外、紫外、原子吸收、發(fā)射光譜），也可將斑點(diǎn)剪下灰化，再用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙?，測(cè)之。 比較法：經(jīng)紙色譜將各種組份分開后，可在相同條件下，制得標(biāo)準(zhǔn)系列圖譜，與待測(cè)斑點(diǎn)顏色、面積進(jìn)行比較，確定其可能的含量。 反射散射光譜法： 物質(zhì)受光照射時(shí)，通常發(fā)

10、生兩種不同的反射現(xiàn)象（即鏡面反射與散射）。鏡面反射同鏡子反射一樣，光線不被物質(zhì)吸收，反射角等于入射角；散射則必須滿足Kubelka-Munk 方程式：其中，R = IR / I0，I0、IR分別為入射光與散射光強(qiáng)度，S為反射系數(shù)，K為線性吸收系數(shù)， 為被測(cè)物的摩爾吸光系數(shù)，C為被測(cè)物的物質(zhì)的量濃度，K = /S。儀器上顯示的反射散射吸收值為AR = lg I0 / IR = lg 1 / R 。由上可建立方程組： ) 1 (CKSCSKR2)R1 ( 2 )2(1lg) 1 (2)1 (2RACKRRR221010CKRRAA 32,1010KCFFRRAA則令 （2）式代入（1）式，得：（3

11、）式即為反射散射吸收光譜測(cè)量值F與C的定量關(guān)系；若以F為縱坐標(biāo)、C為橫坐標(biāo)，則可得一截踞為2的直線，斜率為K。圖1. 反射散射附件的光路示意圖M: 反射鏡; S: 樣品: PC: 光電管 1234sMPCM1長頸漏斗， 2濾紙，3墊板， 4抽濾瓶 F. 應(yīng)用例氨基酸的分離（固定相為水）例2. 糖的分離(固定相為水)例脂肪酸的分離（固定相為水）例4. 胺類的分離（固定相為水）例5. 醇、酚的分離（固定相為水）例核酸降解物（核苷酸、嘌呤、嘧啶堿基）的分離（固定相為水）例. 其它類的分離（固定相為水）例8無機(jī)應(yīng)用（固定相為水）例9生物學(xué)應(yīng)用FeCuCoNiNiNiNiTiMo黑毛紅毛黃毛白毛 兔毛的

12、色譜圖毛發(fā)是這樣,皮膚是否是這樣 ? ?取不同顏色兔毛(300 500 mg), 干法灰化, 溶于稀HCl 中,用丙酮 : 丁醇 : HCl = 10 : 4 : 2, 展開后,顯色用紙色譜法分離A、B兩種物質(zhì)，在某條件下兩物質(zhì)的比移值Rf分別為0.36、0.40。設(shè)A、B兩物質(zhì)斑點(diǎn)的直徑分別為0.2 cm,0.4 cm,當(dāng)展開劑的前沿達(dá)到10 cm時(shí)，A、B能否完全分離?設(shè)A、B兩物質(zhì)色譜斑點(diǎn)的中心距原點(diǎn)分別為x1,x 2 cm,則x1/10 = 0.36 x2/10 = 0.40 x2-x1 = (0.40-0.36)10 = 0.4(cm)欲分離兩物質(zhì)，兩斑點(diǎn)中心距離至少為(0.20+0

13、.40)/2 = 0.30cm,而實(shí)際兩斑點(diǎn)中心距離為0.4 cm ,故在此條件下A B兩物質(zhì)可得到完全分離。 用紙色譜分離混合物中物質(zhì)A和B，已知兩者的比移值分別為0.50和0.60，問欲使層析后斑點(diǎn)顯著分開，斑點(diǎn)間至少間隔1cm，(斑點(diǎn)直徑都是1cm)問濾紙應(yīng)截取多長？解： 設(shè)前沿為l，原點(diǎn)到A、B斑點(diǎn)中心距離分別為a、b，兩斑點(diǎn)間至少間隔1cm，那么兩斑點(diǎn)中心相距為2.0cm，則可列出：原點(diǎn)應(yīng)距濾紙下端4cm，前沿應(yīng)距濾紙上端2-3cm，應(yīng)截取濾紙長20+4+2=26cm,濾紙條應(yīng)截取26-27cm長。cm20l0 .2l50.0l60.00 .2ab60.0lb50.0la用紙色譜法分

14、離A、B兩種物質(zhì)，在一定條件下A、B兩物質(zhì)的比移值分別為0.35,0.45，設(shè)A、B兩物質(zhì)色譜斑點(diǎn)的直徑分別為0.50cm和0.80cm,要求展開劑前沿至少達(dá)到多少厘米時(shí)，A和B才能完全分離?設(shè)x1, x2分別為AB兩物質(zhì)斑點(diǎn)距原點(diǎn)的距離：則 x1/y=0.35 x2/y =0.45 x2-x1=0.40+0.25=0.65又 x2-x1=(0.45-0.35)y =0.65 y =6.5(cm)紙色譜法分離混合離子,若混合離子極性大小順序?yàn)锳BC,用弱極性有機(jī)溶劑展開后其Rf值大小順序?yàn)開。 C, B, A 第二節(jié)、薄層色譜法 原理和特點(diǎn)原理: 當(dāng)展開劑從薄板上固定相的空隙中通過時(shí), 由于各

15、組分的K的不同和足夠多次的分配.特點(diǎn):裝置簡、操作方便展開時(shí)間短樣品負(fù)荷量大、斑點(diǎn)擴(kuò)散少缺點(diǎn)：Rf值的重復(fù)性差克服辦法：標(biāo)樣和試樣在同一塊板上展開同一張色譜圖可用不同的試劑顯斑，也可用濃硫酸等強(qiáng)氧化劑或在400 500 加熱碳化檢出。適用面廣，可用不同吸附劑或展開劑。 吸附劑（固定相）決定吸附性能的因素：吸附劑的化學(xué)組成、活性、表面積要求：合適的吸附力與展開劑、被吸附物質(zhì)均不起化學(xué)反應(yīng)粒度細(xì)小而且均勻（范氏方程，減少渦流擴(kuò)散項(xiàng)）對(duì)不同的組分有不同的吸附量,因而能較好的把試樣中各組分分離。在所有的溶劑和洗脫劑中不溶解。（）氧化鋁層析用的商品氧化鋁根據(jù)制備的酸度不同可分為如下三種類型： a酸性氧化

16、鋁：pH=3.54.5,適用于分離酸性化合物，如某些酸性色素、二羧酸氨基酸、酸性多肽以及對(duì)酸性穩(wěn)定的中性物質(zhì)。b 中性氧化鋁：pH=6.97.1,應(yīng)用較廣泛，適用分離生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體、蒽醌以及在酸堿中不穩(wěn)定的酯、內(nèi)酯等化合物?？捎糜诜蛛x酸性或堿性氧化鋁分離的物質(zhì)C 堿性氧化鋁:pH=910，酸性較強(qiáng)的化合物在堿性氧化鋁上吸附的很牢（所以，酸性物質(zhì)分離不好），故通常用于分離碳?xì)浠衔?、生物堿類和對(duì)堿性物質(zhì)比較穩(wěn)定的中性物質(zhì)、堿性物質(zhì)。一般薄板要求把氧化鋁活化成 級(jí)使用氧化鋁的活性與含水量密切相關(guān)（含一定量的水份時(shí)，吸附劑表面的吸附中心會(huì)被水分子占據(jù)）故加熱驅(qū)除水活化；加入一定量的水失活

17、 100 150oC, 除去Al2O3中與羥基結(jié)合的部分水份，使Al2O3有一定的活性150 300oC， Al2O3活性達(dá) 級(jí)300 400oC，Al2O3活性達(dá) 級(jí) 600oC， Al2O3進(jìn)一步脫水并開始燒結(jié) 由于脫水過程受到許多因素的影響，因此，每批生產(chǎn)的Al2O3 ，其表面積和表面孔穴結(jié)構(gòu)并不一致，活性也不相同。 Al2O3活性的測(cè)定：取20 L染料溶液（偶氮苯30 mg、對(duì)甲氧基偶氮苯、蘇丹黃、蘇丹紅、和對(duì)氨基偶氮苯各20 mg ，溶解于50 mL CCl4中），加到薄板上，用CCl4展層，根據(jù)下表確定活性。市售的供薄層色譜用的Al2O3有:Al2O3 H氧化鋁中無粘合劑Al2O3

18、 G氧化鋁中含煅石膏（一般5煅石膏）煅石膏CaSO4，作為粘合劑Al2O3 HF254氧化鋁中不含煅石膏，僅含熒光指示劑（在254 nm下呈黃綠色熒光）Al2O3 GF254氧化鋁中既含煅石膏又含熒光指示劑（在254 nm下呈黃綠色熒光）上述商品可以直接調(diào)料涂敷（1份料，2份水調(diào)合）（）硅膠（吸附性較Al2O3弱）硅膠是微酸性吸附劑，且適用于酸性、中性物質(zhì)的分離（如有機(jī)酸、氨基酸、萜類、甾體）堿性物質(zhì)則能與硅膠作用（當(dāng)用中性溶劑展層，堿性物質(zhì)有時(shí)停留在原點(diǎn)不動(dòng)，或者得到拖尾的斑點(diǎn)，而不能很好的分離）注:硅膠薄層的活化溫度不能高于200oC硅膠的吸附能力也跟其含水量有關(guān)，其吸附能力也分為五級(jí)硅膠

19、的結(jié)構(gòu)為:HOSi( OSi) OSiOHOHOHOHOHOHOH n硅膠活性的測(cè)定：稱取二甲黃、蘇丹紅、靛酚藍(lán)各40mg溶于100 mL 苯中，將此混合液滴加于薄層上，用石油醚展開10 cm，混合物應(yīng)不動(dòng)；如用苯展開，則應(yīng)分成三個(gè)斑點(diǎn)，其Rf值分別為：二甲黃0.58，蘇丹紅0.19，靛酚藍(lán)0.08（展層時(shí)間30 45 min），則認(rèn)為此硅膠合格。經(jīng)本法測(cè)定的活性與Al2O3活性 級(jí)相當(dāng)。薄層用商品硅膠有：硅膠H（不含粘結(jié)劑）、硅膠G（含粘結(jié)劑煅石膏）、硅膠HF254（含熒光物質(zhì)的硅膠）硅膠GF254（含有煅石膏和熒光劑）此外，硅藻土、硅酸鹽、雜多酸鹽、聚酰胺、纖維素也可用作吸附劑。(3).

20、選擇吸附劑的規(guī)律：v極性物質(zhì)被極性表面的吸附劑吸附；v親水性的吸附劑適用于在非水溶液中吸附物質(zhì)；v疏水性的吸附劑適用于在水溶液中吸附物質(zhì)展開劑（流動(dòng)相） 展開劑的洗脫作用實(shí)質(zhì)是展開劑分子與欲分離組分竟?fàn)幷紦?jù)表面吸附中心的過程。 強(qiáng)極性展開劑分子占據(jù)吸附中心的能力強(qiáng)，所以，有強(qiáng)的洗脫作用，非極性展開劑分子占據(jù)吸附中心的能力弱，所以，有弱的洗脫作用。（1）常用展開劑的極性： 石油醚環(huán)己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇吡啶酸（2）欲分離組分的極性：v飽和碳?xì)浠衔锵捣菢O性化合物，不被吸附或吸附不牢。在其結(jié)構(gòu)中引進(jìn)某些功能團(tuán)則極性增加。取代基團(tuán)極性越強(qiáng)，整個(gè)分子極性

21、越強(qiáng)。常見功能團(tuán)按其極性增加的順序是： 烷烴烯烴醚類硝基化合物二甲胺酯類酮類醛類硫醇胺類酰胺醇類酚類羧酸類 v當(dāng)有機(jī)分子的基本母核相同時(shí)，極性基團(tuán)越多，整個(gè)分子的極性越大v分子的雙鍵越多，吸附能力越強(qiáng)；共軛雙鍵越多，吸附能力越強(qiáng)v分子中取代基團(tuán)的空間排列對(duì)吸附性也有影響，如同一母核中羥基處于能形成內(nèi)氫鍵位置時(shí)，其吸附能力弱于不能形成內(nèi)氫鍵的化合物（3）展開劑選擇的基本原則吸附薄層分配薄層展開劑的選擇原則是根據(jù)物質(zhì)在展開劑的溶解度，或根據(jù)物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同而進(jìn)行的一般在選擇展開劑時(shí)可將試樣中各組分溶解度相差最大的溶劑組成展開劑離子交換薄層展開劑是根據(jù)被分離物質(zhì)是酸還是堿，是陰離

22、子還是陽離子凝膠薄層常用于分離不同分子量的非離子化分子的混合物常用的展開劑是水或鹽的水溶液、緩沖液等4. 操作技術(shù)（1）制板玻璃板 a .平整、去油、去污（可用濃H2SO4-K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自來水洗凈后，烘干）b. 玻璃板的尺寸根據(jù)自己的需要自由選擇，小的可用2.57.5cm的載玻片, 大的可用20 20cm的玻片。涂布液 取一定量的吸附劑放入研缽中，加入需要的水或適當(dāng)?shù)娜軇?，研磨時(shí)間以調(diào)成稀糊狀為度，當(dāng)濃度均一后，即成膠狀物，色澤潔白為最佳，立即傾入玻璃板上，用下述方法涂布。涂布方法:玻棒涂布玻片刮涂傾斜涂布（利用流平性）-簡，但均勻性差涂布器活化 薄板首先風(fēng)干，否則濕板一

23、下加熱到高溫，烘出的薄板很酥松，使用效果不好。 氧化鋁G板在150 160oC, 烘4小時(shí)(級(jí)左右) 硅膠G板在110oC烘1小時(shí) 薄板經(jīng)活化后，一定要儲(chǔ)藏在密閉的干燥器或烘箱中備用。(2)點(diǎn)樣適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)樣量，集中的斑點(diǎn)是得到一個(gè)好的色譜的必要條件。如何才適當(dāng)？不同的分離要求、不同的薄板（有厚有?。?、不同的吸附劑（性能不一），需要不同的點(diǎn)樣量。從下圖可見：點(diǎn)樣量少了，不易檢出；點(diǎn)樣量多了，易拖尾或擴(kuò)散，影響分離效果。0.12503000.50.30.1Rfgv純物質(zhì)的鑒定，若又有高靈敏度的顯色劑，點(diǎn)樣量只需g或ng；v若進(jìn)行天然物或中間產(chǎn)物的分離時(shí)，點(diǎn)樣量需50 g幾百微克；v若進(jìn)行制備色譜，進(jìn)

24、樣量可達(dá)1mg。v點(diǎn)樣時(shí)可用內(nèi)徑約1mm，管口平整的毛細(xì)管或微量吸管吸取試液后，輕輕接觸板面，分?jǐn)?shù)次滴加樣品。注意點(diǎn)：a.溶解試樣的溶劑最好是揮發(fā)性的b.點(diǎn)樣宜分幾次點(diǎn)加,即點(diǎn)一次后, 用吹風(fēng)機(jī)的冷風(fēng)吹干, 再點(diǎn), 再吹干, ., 反復(fù),直到點(diǎn)完所要求的量c. 點(diǎn)樣量的體積盡可能小些(2 10L左右)d. 點(diǎn)樣最好是在密閉的室中或比較干燥的環(huán)境下完成, 避免薄板吸水降低活性.15cm2.5cm1.5cm溶劑前沿溶劑前沿（）展層薄層的展開需在密閉的器皿中進(jìn)行，密閉容器應(yīng)用展開溶劑予先飽和。展開方式和紙層析相同。但不加粘合劑的薄板只能作近水平式（與平面成20 10oC角）的上行或下行的展層而不能垂

25、直展層。把點(diǎn)好樣品的薄板浸入0.5cm深的適宜展開劑中，當(dāng)展開劑移動(dòng)至離起點(diǎn)約10 20cm處(約30min)，將薄板取出放平，用鉛筆或小針記下溶劑前沿的位置后，在室溫干燥或烘箱內(nèi)干燥，測(cè)其Rf值。注意：每次的展層距離要固定，以便Rf值的重復(fù)v二次展開對(duì)于組成比較復(fù)雜的試樣，一次展開不能使各組分完全分離，可用另一種（或同一種）展開劑進(jìn)行第二次展開v連續(xù)展開某些組分比移值較小且分離較難，可采用連續(xù)展開v雙相展開對(duì)組分較多性質(zhì)接近的難分離試樣，用雙向展開可獲得較好的效果（）檢出 a.本身是有色物，可以直接觀測(cè)斑點(diǎn)的位置和顏色 b.本身無色但在紫外線的照射下會(huì)發(fā)出不同顏色的熒光 c.薄板本身有熒光（硅膠HF254+366, 硅膠GF254, .), 欲測(cè)物吸收紫外線, 在熒光背景下呈暗色d.多數(shù)有機(jī)物, 噴10 50%