PCR室室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、PCRg室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 .目的 控制實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、精密度，并檢測(cè)其準(zhǔn)確度的改變， 提高本室常規(guī)工作中的批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測(cè)的一致性。2 .適用范圍本程序適用臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)量負(fù)責(zé)人和檢驗(yàn)人員對(duì)DNA和RNA分析的室內(nèi)質(zhì)量控制。3 .制定依據(jù)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)中子瑜 李金明主編 人民衛(wèi)生生版社2002年第一版4 .職責(zé) 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量負(fù)責(zé)人和檢驗(yàn)人員負(fù)責(zé)本規(guī)程的執(zhí)行。評(píng)估檢測(cè)結(jié)果正確與否， 判定當(dāng)日結(jié)果是否可以被采用。5、操作步驟5.1 血清質(zhì)量控制品a）質(zhì)控品的來(lái)源：衛(wèi)生部臨檢中心或試劑盒內(nèi)質(zhì)控品。b）質(zhì)控品與樣本同時(shí)處理，排列順序?yàn)椋簶?biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品，陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品，臨床樣本。c

2、）質(zhì)控品的處理及分析判斷。d）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷：實(shí)驗(yàn)結(jié)果合格，即發(fā)報(bào)告；實(shí)驗(yàn)結(jié)果不 合格，報(bào)告室主任，會(huì)同有關(guān)人員，查找原因，妥善解決。e）記錄每次檢測(cè)質(zhì)控結(jié)果。f）記錄失控原因及糾正措施。5.2 室內(nèi)質(zhì)控圖的使用方法：描點(diǎn)：a）圖中X裝為靶線，X±2s為警告線，X± 3s為失控線。對(duì)于同一批號(hào)的質(zhì)控血清不論使用幾個(gè)月，其空?qǐng)D均不變化。只要將圖紙上方“起止日期”項(xiàng)填入每個(gè)月的實(shí)際起止日期即可。b）每天將該批號(hào)質(zhì)控血清按有關(guān)規(guī)定程序復(fù)融隨同病人的標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)。將日期、檢測(cè)結(jié)果和操作者如實(shí)記錄在圖下方的相應(yīng)位置，并按前面的方法畫由圖上的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，用直線 將該點(diǎn)與前一天的點(diǎn)連接。c）

3、月底計(jì)算當(dāng)月全部質(zhì)控血清檢測(cè)結(jié)果的X、s和CV,并進(jìn)行圖形分析和小結(jié)，將質(zhì)量控制圖存入質(zhì)控資料檔案。圖形分析a）如果在X± 3s線以外，則為失控，應(yīng)立即報(bào)告有關(guān)負(fù)責(zé) 人，迅速查找原因。必要時(shí)復(fù)測(cè)標(biāo)本，然后方可發(fā)生報(bào)告， 并將失控情況、查找過(guò)程及處理結(jié)果等詳細(xì)記錄。b）如果在X± 2s線以外，或由現(xiàn)連續(xù) 6點(diǎn)以上在一側(cè)等規(guī) 律變化，均應(yīng)立即向有關(guān)負(fù)責(zé)人反映，并積極查找原因。但 當(dāng)天的檢驗(yàn)結(jié)果一般可以發(fā)生。通過(guò)觀察圖形的規(guī)律性變化進(jìn)行誤差分析，消除誤差來(lái)源 a）曲線漂移：提示有系統(tǒng)誤差，準(zhǔn)確度發(fā)生了一次性的向 上或向下改變。這種變化往往是由于一個(gè)新的情況引起的。如更換不同批號(hào)試

4、劑，啟用新批號(hào)的質(zhì)控血清、操作人員的變換等。在找原因時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)注意“漂移”前后發(fā)生了那些變動(dòng)的因素。b）趨勢(shì)性變化：向下或向上的趨勢(shì)性變化表明檢測(cè)的準(zhǔn)確 度發(fā)生了漸漸地變化。這種變化往往是由于一個(gè)逐漸改變的 因素造成的。如質(zhì)控血清的降解，試劑效價(jià)的降低等。c）連續(xù)多點(diǎn)分布在靶值一側(cè)：目前，一般認(rèn)為質(zhì)控血清的檢 測(cè)結(jié)果連續(xù)6天以上由現(xiàn)在靶值同一側(cè)，則應(yīng)迅速查找原因， 爭(zhēng)取盡快使之回復(fù)圍繞在靶值隨機(jī)分布的狀態(tài)。因?yàn)榘凑战y(tǒng) 計(jì)學(xué)原理，由純隨機(jī)誤差造成的這種情況的可能性很小。連 續(xù)6天以上由現(xiàn)在靶值同一側(cè)可能性小于1.5 %。因此凡由現(xiàn)連續(xù)6天以上由現(xiàn)在靶值同一側(cè)者均有可能存在非隨機(jī)誤 差因素。如結(jié)果

5、與靶值偏離并不太大，不會(huì)給臨床使用帶來(lái) 太大影響時(shí)，一般化驗(yàn)報(bào)告可以照常填發(fā)。d）其他規(guī)律變化：（周期性等）5.3 通過(guò)圖形的資料對(duì)比進(jìn)行誤差分析，消除誤差來(lái)源a）每個(gè)月的月底將該月的全部質(zhì)控血清檢測(cè)基果的 X和s與 該批測(cè)定的X和s進(jìn)行比較。如果X發(fā)生了變化，說(shuō)明準(zhǔn)確 度發(fā)生了變化提示有非隨機(jī)誤差存在。如果當(dāng)月 s不同側(cè)表 明檢測(cè)的精密度發(fā)生了變化。b）將使用同一批號(hào)質(zhì)控血清的 CT值的X和s按月份列出。 如果X逐在月上升，應(yīng)考慮保存不當(dāng)造成的試劑效價(jià)降低或 質(zhì)控血清本身由現(xiàn)降解。如果各月份X基本一致而s逐月加大，則主要提示常規(guī)工作的精密度下降，應(yīng)重點(diǎn)從操作、管 理上找原因。5.4 失控限的

6、判定：當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照呈假陰性或陰性質(zhì)控呈假陽(yáng)性時(shí)為失控；當(dāng)陽(yáng)性標(biāo)本呈假陰性或陰性標(biāo)本呈假陽(yáng)性時(shí)為失控。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不合格，報(bào)告室主任，會(huì)同有關(guān)人員，查找原因，妥善解決，并將失控情況、查找過(guò)程及處理結(jié)果 等詳細(xì)記錄。5.5 陰性對(duì)照品失控的處理程序：5.5.1 陰性對(duì)照A、B為假陽(yáng)性時(shí)，則應(yīng)考慮為：a.試劑污染; b. 擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”?？勺饕韵聦?shí)驗(yàn)鑒定：取4 個(gè)空管打開(kāi)靜置于標(biāo)本制備區(qū)60 分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時(shí)以水替代核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增，如為陽(yáng)性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合物的管為陰性，即可排除試劑污染的可能，表示實(shí)驗(yàn)室有擴(kuò)增產(chǎn)物“污染”。此時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，然后先暫時(shí)停止 PC

7、R實(shí)驗(yàn)，采取各種有效的消毒清潔工作直 至產(chǎn)物污染徹底消失后才可進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。如果有試劑污染時(shí)，應(yīng)更換另一批號(hào)的試劑進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，待重復(fù)實(shí)驗(yàn)陰性質(zhì)控品無(wú)失控后，方可報(bào)告結(jié)果。5.5.2 如果以上實(shí)驗(yàn)鑒定沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室的產(chǎn)物污染時(shí)，則應(yīng)判斷為實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中所致的標(biāo)本間的交叉“污染”，出現(xiàn)這種情況很大程度上屬于偶然誤差，具體地說(shuō)，如強(qiáng)陽(yáng)性的標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染，強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用的離心管核酸提取時(shí)在較高溫度溫育時(shí)蓋子崩開(kāi)。因此在PCR實(shí)驗(yàn)前離心管、濾心吸頭的質(zhì)檢以及在實(shí)驗(yàn)中一發(fā)現(xiàn)手套可能有污染就立即更換手套顯得尤為重要，并且PCRU驗(yàn)人員的嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的工作態(tài)度

8、是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。5.6 陽(yáng)性對(duì)照品失控的處理程序：5.6.1 臨界陽(yáng)性對(duì)照品失控的原因有：a. 臨界對(duì)照品是否還好：可更換新的臨界對(duì)照品，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果對(duì)照品無(wú)失控則表示上次實(shí)驗(yàn)的臨界對(duì)照品已失效， 不能再用于實(shí)驗(yàn)。如果還有失控現(xiàn)象，則應(yīng)考慮：b. 核酸提取過(guò)程中的隨機(jī)誤差：如核酸性對(duì)照失控。如核酸提取中的丟失、裂解溫度不夠、裂解不充分、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。應(yīng)重新嚴(yán)格核查該過(guò)程中的各步驟是否出錯(cuò)，然后重新操作一遍，臨界對(duì)照品無(wú)失控現(xiàn)象后才報(bào)告結(jié)果。如果仍失控，則考慮：儀器問(wèn)題b. 儀器問(wèn)題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。此時(shí)應(yīng)請(qǐng)廠

9、家及時(shí)校正儀器。儀器校正好之后再重復(fù)操作如無(wú)失控則可報(bào)告結(jié)果。如果仍有失控現(xiàn)象則應(yīng)考慮：試劑問(wèn)題c. 試劑的問(wèn)題：如Taq 酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率、試劑的靈敏度等?？筛鼡Q另一批號(hào)的試劑重復(fù)實(shí)驗(yàn)，無(wú)失控結(jié)果后才可發(fā)出報(bào)告。5.6.2 強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照品失控的原因和臨界陽(yáng)性對(duì)照品失控的原因基本相同，但最首要的原因應(yīng)考慮試劑的問(wèn)題。由此可見(jiàn)，在PCR實(shí)驗(yàn)前對(duì)試劑的質(zhì)檢是必不可少的環(huán)節(jié)之一。5.7 陽(yáng)性標(biāo)本失控的處理程序：5.7.1 失控的主要原因有：a. 標(biāo)本的收集是否符合要求（包括標(biāo)本采集的時(shí)間是否合適、標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備工作是否適度、標(biāo)本的類型和采集量是否合適、采集的標(biāo)本所

10、含的細(xì)胞數(shù)量和核酸總量是否足夠、采樣容器是否合格。） ；b. 標(biāo)本保存是否正確；c. 標(biāo)本的運(yùn)送是否延誤；d. 標(biāo)本在核酸制備、擴(kuò)增檢測(cè)中所存在的隨機(jī)誤差（與上述陽(yáng)性質(zhì)控品的失控原因相同）。5.7.2 處理程序：a. 如果是標(biāo)本收集、標(biāo)本保存、標(biāo)本運(yùn)送等環(huán)節(jié)所導(dǎo)致陽(yáng)性標(biāo)本失控，則應(yīng)嚴(yán)格按要求重取標(biāo)本后復(fù)查才可報(bào)告結(jié)果。另外還應(yīng)對(duì)臨床標(biāo)本采集人員、標(biāo)本運(yùn)送相關(guān)人員進(jìn)行必要的培訓(xùn)。b. 如果是標(biāo)本的核酸制備、擴(kuò)增檢測(cè)中所存在的隨機(jī)誤差問(wèn)題，則可參照以上所述陽(yáng)性質(zhì)控品失控的處理方法，另外對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)人員的培訓(xùn)非常重要。5.8 陰性標(biāo)本失控的處理程序：5.8.1 主要原因有：a. 標(biāo)本采集容器是否合格（是否使用一次性采樣材料、使用的玻璃器皿是否經(jīng)過(guò)高壓滅菌）；b. 標(biāo)本運(yùn)送過(guò)程是否存在污染因素（如沒(méi)有密閉、管漏等）c. 標(biāo)本在核酸制備、擴(kuò)增檢測(cè)中所存在的隨機(jī)誤（與上述陰性質(zhì)控品的失控原因相同）5.8.2 處理程序：a.