DNA體外重組技術(shù)介紹PPT課件

1、第五章第五章DNA體外重組技術(shù)體外重組技術(shù)概述一、一、DNADNA重組技術(shù)相關(guān)概念重組技術(shù)相關(guān)概念 克隆克隆(clone)(clone)來自于同一始祖的一群相同分子、細(xì)菌、細(xì)來自于同一始祖的一群相同分子、細(xì)菌、細(xì)胞胞或動物（常被成為副本或拷貝）?；騽游铮ǔ１怀蔀楦北净蚩截悾??？寺』寺』?cloning)(cloning)獲取大量單一拷貝的過程，也稱無性繁殖。獲取大量單一拷貝的過程，也稱無性繁殖。DNA克隆克隆(DNA cloning)應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然

2、的或人工的的或人工的DNA）與載體）與載體DNA接合成一具有自我接合成一具有自我復(fù)制能力的復(fù)制能力的DNA分子。分子。繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，又分子，又稱基因克隆稱基因克隆(gene cloning)或分子克隆或分子克隆(molecular cloing)。 “克隆克隆”某一基因或某一基因或DNA片段過程中，片段過程中，將外源將外源DNA插入載體分子所形成的復(fù)制子插入載體分子所形成的復(fù)制子是雜合分子嵌合是雜合分子嵌合DNA，所以，所以D

3、NA克隆又克隆又稱重組稱重組DNA (recombinant DNA)。 實現(xiàn)實現(xiàn)DNA克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱DNA重組技術(shù)重組技術(shù)(recombinant DNA technology)，又稱基因工程又稱基因工程(genetic engineering)。二、二、DNADNA重組技術(shù)基本程序重組技術(shù)基本程序外源外源DNA的獲取的獲取DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌目的基因與載體的連接目的基因與載體的連接克隆載體的選擇與構(gòu)建克隆載體的選擇與構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 三、三、DNADNA重組的基本步驟重組的基本步驟+連接轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定

4、陽性克隆含重組子的陽性克隆載體目的基因分、切、接、轉(zhuǎn)、篩克隆基因表達(dá)克隆基因表達(dá)第一節(jié)DNA體外重組載體的種類與選擇體外重組載體的種類與選擇載體（載體（vector）：能攜帶外源基因進(jìn)入受）：能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞體細(xì)胞, 并在其中進(jìn)行擴(kuò)增或誘導(dǎo)外源基并在其中進(jìn)行擴(kuò)增或誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的工具。因表達(dá)的工具。* 作為基因工程載體所需具備的基本條件：作為基因工程載體所需具備的基本條件：1. 有自身的復(fù)制子，能借助自身的復(fù)制和調(diào)控對有自身的復(fù)制子，能借助自身的復(fù)制和調(diào)控對攜帶的目的基因進(jìn)行復(fù)制和增殖。攜帶的目的基因進(jìn)行復(fù)制和增殖。3. 有多個利于選擇和篩選的遺傳表型或標(biāo)志，包括有多個利于選擇和篩

5、選的遺傳表型或標(biāo)志，包括抗藥性、營養(yǎng)缺陷型、噬菌斑形成及顯色反應(yīng)。抗藥性、營養(yǎng)缺陷型、噬菌斑形成及顯色反應(yīng)。2. 有多克隆位點有多克隆位點(多種酶單一位點多種酶單一位點)，易于外源，易于外源DNA分子與載體及重組。分子與載體及重組。 4. 表達(dá)型載體還應(yīng)有強(qiáng)啟動子、前導(dǎo)序列、增表達(dá)型載體還應(yīng)有強(qiáng)啟動子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。強(qiáng)子等調(diào)控元件。（一）按功能分類（一）按功能分類（二）按受體細(xì)胞分類（二）按受體細(xì)胞分類（三）按載體來源分類（三）按載體來源分類一、載體的分類一、載體的分類克隆型載體克隆型載體表達(dá)型載體表達(dá)型載體原核細(xì)胞載體原核細(xì)胞載體真核細(xì)胞載體真核細(xì)胞載體（穿梭載體）（穿梭載體）

6、原核克隆型載體原核克隆型載體原核表達(dá)型載體原核表達(dá)型載體真核表達(dá)型載體真核表達(dá)型載體真核轉(zhuǎn)遞型載體真核轉(zhuǎn)遞型載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體噬菌體載體噬菌體載體病毒載體病毒載體酵母人工染色體酵母人工染色體粘性載體粘性載體 細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒擴(kuò)增并表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌染色質(zhì)質(zhì)粒定義定義: 細(xì)菌染色質(zhì)以外的雙鏈環(huán)狀細(xì)菌染色質(zhì)以外的雙鏈環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。二、不同載體的特點與分類二、不同載體的特點與分類（一）質(zhì)粒載體（一）質(zhì)粒載體1. 質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)基因克隆的質(zhì)粒載體具備的特點：基因克隆的質(zhì)粒載體具備的特點： 分子相對較小，具有較高的拷貝數(shù)

7、分子相對較小，具有較高的拷貝數(shù) 含高效的復(fù)制子，可用氯霉素阻止細(xì)菌蛋白含高效的復(fù)制子，可用氯霉素阻止細(xì)菌蛋白 質(zhì)的合成，非使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加。質(zhì)的合成，非使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加。 具有多種遺傳選擇標(biāo)記，包括各種抗藥基因具有多種遺傳選擇標(biāo)記，包括各種抗藥基因 或營養(yǎng)代謝基因等。或營養(yǎng)代謝基因等?？顾幓蚧驙I養(yǎng)代謝基因抗藥基因或營養(yǎng)代謝基因 氨芐青霉素抗性基因（氨芐青霉素抗性基因（ampr）:編碼編碼-內(nèi)酰胺酶，水解內(nèi)酰胺酶，水解amp -內(nèi)酰胺環(huán)使內(nèi)酰胺環(huán)使amp失效失效 四環(huán)素抗性基因（四環(huán)素抗性基因（tetr）：編碼轉(zhuǎn)膜泵）：編碼轉(zhuǎn)膜泵將將tet從細(xì)胞移出從細(xì)胞移出 大腸桿菌大腸桿菌LacZ基因

8、：編碼半乳糖苷酶，基因：編碼半乳糖苷酶，分解分解X-gal，使菌落為藍(lán)色。，使菌落為藍(lán)色。AmprORITetrpBR322質(zhì)粒：一種克隆質(zhì)粒質(zhì)粒：一種克隆質(zhì)粒ORI：復(fù)制起始點，：復(fù)制起始點，保證高拷貝自我復(fù)制。保證高拷貝自我復(fù)制。結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：Ampr, Tetr：兩個抗性基因用于兩個抗性基因用于篩選陽性克隆。篩選陽性克隆。Pst I, BamH I：兩個單酶切位點用于兩個單酶切位點用于插入目的基因插入目的基因AmprLacZMCSpfxBlue: 克隆質(zhì)?？寺≠|(zhì)粒MCS：Multiple Clonning Site提供多個單酶切位點用于克隆操作LacZ: 藍(lán)白斑篩選陽性克隆藍(lán)白斑篩選陽性克

9、隆pUC18/pUC19pUC192686 bpAmprLac ZP(BLA)PlacOriAva I (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)Pst I (440)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367)MCSpcDNA3：真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒：真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒Pcmv：CMV增強(qiáng)子增強(qiáng)子/啟動子啟動子 驅(qū)動目的基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)BGH pA：加尾信號：加尾信號 目的基因轉(zhuǎn)錄后加上polyA尾，使其更穩(wěn)定。（二）（二） 噬菌體噬菌體 A WB DEF Z J att xis

10、N cl cro O P Q SR 結(jié)構(gòu)區(qū) 重組區(qū)重組區(qū)調(diào)控區(qū)裂解區(qū)cos位點位點 cos 位點ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置換型 噬菌體作為載體具有兩個特點噬菌體作為載體具有兩個特點 噬菌體生長繁殖所必需的序列位于其噬菌體生長繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌體基因組中央含有左右二臂上，噬菌體基因組中央含有30%的的DNA是是噬菌體生長所非必需的。噬菌體生長所非必需的。 噬菌體的成熟需要包裝，當(dāng)與外源噬菌體的成熟需要包裝，當(dāng)與外源DNA重組后的大小介于原來的重組后的大小介于原來的75%105%之間時，重組的之間時，重組的DNA分子才可包分子才可包裝為成熟的噬菌體顆

11、粒。裝為成熟的噬菌體顆粒。 噬菌體的種類：噬菌體的種類：Charon系列、系列、 gt系列、系列、EMBL系列系列（三）粘粒載體（三）粘粒載體（cosmid) 質(zhì)粒序列：復(fù)制原點，抗性標(biāo)志質(zhì)粒序列：復(fù)制原點，抗性標(biāo)志 噬菌體：噬菌體：cos粘端序列粘端序列 插入片段長度可以是載體本身長度的插入片段長度可以是載體本身長度的7-10倍倍（四）（四） 酵母人工染色體載體酵母人工染色體載體(YAC)質(zhì)粒質(zhì)粒pBR322衍生物衍生物酵母基因酵母基因著絲粒著絲粒端粒端粒自主復(fù)制順序自主復(fù)制順序復(fù)制起點復(fù)制起點(ori)Ampr基因基因組成組成用途用途構(gòu)建真核生物基因組構(gòu)建真核生物基因組DNA文庫文庫第二節(jié)

12、基因工程中常用工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶(II(II型型) )切切分子克隆的手術(shù)刀分子克隆的手術(shù)刀定義：定義：由細(xì)菌自己產(chǎn)生的一種能識別和切由細(xì)菌自己產(chǎn)生的一種能識別和切割割DNA內(nèi)部特定序列的一類核酸酶內(nèi)部特定序列的一類核酸酶有嚴(yán)格的識別、切割順序，以內(nèi)切方式有嚴(yán)格的識別、切割順序，以內(nèi)切方式水解雙鏈水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段片段5 端為端為P，3端為端為OH。識別順序一般為識別順序一般為46個堿基，通常為回個堿基，通常為回文結(jié)構(gòu)，即具有文結(jié)構(gòu)，即具有180反向重復(fù)。反向重復(fù)。 如如CATATG(1). 產(chǎn)生平頭末端產(chǎn)生平頭末端(

13、blunt end)Hae*GGCC*CCGG*5353型酶切割雙鏈型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生：產(chǎn)生：一、限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353(2). 產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生粘性末端(sticky end)一、限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶酶單位定義：酶單位定義： 在適當(dāng)反應(yīng)條件下，在適當(dāng)反應(yīng)條件下，1h內(nèi)在內(nèi)在50l體體系中完全酶解系中完全酶解1g特定特定DNA底物所需酶底物所需酶量，定為量，定為1個活性單位。個活性單位。 出售的內(nèi)切酶幾乎均以出售的內(nèi)切酶幾乎均以DNA作底物作底物測其酶活性單位。測其酶活性單位。星活性星活性: 酶切反應(yīng)條件不能滿

14、足最適酶切反應(yīng)條件不能滿足最適條件條件,導(dǎo)致某些酶產(chǎn)生第二活性導(dǎo)致某些酶產(chǎn)生第二活性.EcoR I* GAATTCAATT標(biāo)準(zhǔn)的酶切體系標(biāo)準(zhǔn)的酶切體系1gDNA，20l總反應(yīng)體積，總反應(yīng)體積，1U酶，推酶，推薦的薦的Buffer和溫度，反應(yīng)和溫度，反應(yīng)1h酶切體系組成酶切體系組成 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇，保存，使根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇，保存，使用，稀釋（避免失活與污染）用，稀釋（避免失活與污染） DNA底物底物 純度，含量純度，含量 反應(yīng)反應(yīng)buffer 嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書 高、中、低鹽高、中、低鹽酶切反應(yīng)體系的建立：酶切反應(yīng)體系的建立：酶切溫度與時間酶切溫度與時間一般為一般為

15、37, 1h 酶切反應(yīng)過程酶切反應(yīng)過程 容積：容積：20l，50l, 酶容積酶容積10%, 即甘即甘油油 5% 注意混勻注意混勻 反應(yīng)終止：反應(yīng)終止： 三種方法三種方法 : 10mM EDTA 或或0.1%SDS; 65，20min; 酚酚/氯仿抽提，乙醇沉淀氯仿抽提，乙醇沉淀 酶切鑒定酶切鑒定 ：瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳酶切反應(yīng)體系的建立：酶切反應(yīng)體系的建立：二、二、DNA聚合酶聚合酶含含3種酶活性：種酶活性：1. 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I 5 3聚合酶活性聚合酶活性 5 3外切酶活性外切酶活性 3 5外切酶活性外切酶活性 催化催化DNA缺口平移反應(yīng)缺口平移反應(yīng),制備制備D

16、NA探針探針(5 3外切酶活性外切酶活性)-主要用途主要用途 DNA序列分析序列分析應(yīng)用：應(yīng)用：二、二、DNA聚合酶聚合酶I2. Klenow片段片段 隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記探針隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記探針-主要用主要用途途 雙脫氧末端終止法進(jìn)行雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA測序測序 cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 DNA 3突出末端進(jìn)行末端標(biāo)記突出末端進(jìn)行末端標(biāo)記用途：用途：(大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I大片段，大片段， 缺缺5 3外切酶活性外切酶活性)二、二、DNA聚合酶聚合酶I PCR反應(yīng)反應(yīng)-主要用途主要用途 DNA測序測序用途：用途：3. Taq DNA聚合酶聚合酶(65kD)耐熱，耐熱

17、， 在在7075時具有最佳的生物活性，時具有最佳的生物活性， 無無3 5外切酶活性外切酶活性(無校正功能）無校正功能）4.反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase, RT)功能：功能： 以以RNA為模板，以帶為模板，以帶3-OH末端的末端的DNA片段為引物，片段為引物， 沿沿5至至3方向合成方向合成DNA鏈。鏈。3AAAAAAUCUGUCCUA5dNTPMg2+反轉(zhuǎn)錄酶3AAAAAAUCUGUCCUA55TTTTTTTOH 3AGACAGGAT31. RNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA聚合酶活性聚合酶活性5TTTTTTT2. DNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；聚合酶活性；RNA酶酶

18、H(35RNA外切酶外切酶)活性活性.4. 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶功能：功能：后者可降解后者可降解DNA-RNA雜交分子中的雜交分子中的RNA反轉(zhuǎn)錄酶缺乏反轉(zhuǎn)錄酶缺乏35核酸外切酶活性核酸外切酶活性,故未校故未校正功能正功能, 會出現(xiàn)錯配會出現(xiàn)錯配.應(yīng)用應(yīng)用最主要是將最主要是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為逆轉(zhuǎn)錄為cDNA三、三、DNA連接酶連接酶(DNA ligase) 基因工程的縫紉針基因工程的縫紉針 催化雙鏈催化雙鏈DNA相鄰堿基相鄰堿基5P和和3-OH間磷間磷酸二酯鍵形成的酶。酸二酯鍵形成的酶。T4噬菌體噬菌體DNA連接酶連接酶-最常用最常用 催化兩個獨立催化兩個獨立DNA片段片段(粘性末端和平末端粘性末

19、端和平末端) 5P和和3-OH之間形成磷酸二酯鍵。之間形成磷酸二酯鍵。主要功能與用途：主要功能與用途：催化平末端連接要比粘性末端催化平末端連接要比粘性末端 效率低得多。效率低得多。修復(fù)雙鏈修復(fù)雙鏈DNA分子中單鏈缺口。分子中單鏈缺口。三、三、DNA連接酶連接酶(DNA ligase) 修復(fù)雙鏈修復(fù)雙鏈DNA分子中單鏈缺口分子中單鏈缺口,并可催并可催化互補(bǔ)粘性末端的連接化互補(bǔ)粘性末端的連接.主要用于主要用于cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成.主要功能與用途：主要功能與用途：(二二) 大腸桿菌大腸桿菌DNA連接酶連接酶 連接粘性末端可代替連接粘性末端可代替T4 DNA連接酶連接酶.四、其他修飾酶四、

20、其他修飾酶功能：功能： 催化多個脫氧核苷酸依次加到單鏈催化多個脫氧核苷酸依次加到單鏈或雙鏈或雙鏈DNA分子的分子的3-OH末端。末端。(一一) 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT) 用途：用途： 1. 主要作用是在載體或目的基因主要作用是在載體或目的基因 3末末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于末端，便于DNA重組。重組。2. DNA 3末端的同位素標(biāo)記。末端的同位素標(biāo)記。催化催化DNA，RNA以及核糖和脫氧核以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的糖三磷酸上的 5 磷酸基團(tuán)水解。磷酸基團(tuán)水解。用途：用途：1. 在連接反應(yīng)中去除載體在連接反應(yīng)中去除載體

21、DNA片段片段5-P，防止載，防止載體自我連接體自我連接.2. 用用32P標(biāo)記標(biāo)記5末端時，用此酶去除末端時，用此酶去除5-P，再用，再用激酶進(jìn)行激酶進(jìn)行5的的 32P標(biāo)記標(biāo)記.(二二) 堿性磷酸酶堿性磷酸酶功能：功能：(三三) 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶(四四) RNase(五五) DNase第三節(jié)目的基因的獲得和修飾-分 通過基因組文庫分離、篩選基因通過基因組文庫分離、篩選基因 通過通過cDNA文庫分離、篩選基因文庫分離、篩選基因 應(yīng)用應(yīng)用PCR或或RT-PCR獲得目的基因獲得目的基因 人工合成基因人工合成基因一、采用限制性內(nèi)切酶酶切法直接分離目的基因 從原核基因組中制備從原核基因組中制

22、備 從真核基因組中制備從真核基因組中制備二、采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因 獲得已知的基因獲得已知的基因 構(gòu)建構(gòu)建RT-PCR文庫法并獲得未知基因文庫法并獲得未知基因 計算機(jī)克隆計算機(jī)克隆三、基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和篩選 基因組文庫基因組文庫(genomic library，G文庫文庫)用基因克隆的方法保存宿主細(xì)胞中的用基因克隆的方法保存宿主細(xì)胞中的DNA重組分子中的集合重組分子中的集合, 所有重組子所含的插所有重組子所含的插入片段的總和代表某種生物基因組全部核入片段的總和代表某種生物基因組全部核苷酸序列。苷酸序列。分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù)分離、篩選基因方法：分

23、子雜交及探針技術(shù) 用目的基因上的一段用目的基因上的一段DNA做成探針與做成探針與文庫中的文庫中的DNA作核酸雜交，從基因文庫中作核酸雜交，從基因文庫中“釣出釣出”有目的基因的克隆。有目的基因的克隆。G文庫構(gòu)建方法：鳥槍法文庫構(gòu)建方法：鳥槍法 cDNA文庫文庫(cDNA library，C文庫文庫)用用基因克隆的方法保存在宿主細(xì)胞中的基因克隆的方法保存在宿主細(xì)胞中的DNA重組體的群體，每一重組子只含一種重組體的群體，每一重組子只含一種mRNA信息，這些重組子的總和包含某種信息，這些重組子的總和包含某種生物的全部生物的全部mRNA序列。序列。C文庫構(gòu)建方法：文庫構(gòu)建方法： 反轉(zhuǎn)錄法合成的反轉(zhuǎn)錄法合

24、成的cDNA與合適的載體重與合適的載體重組并導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成的組并導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成的分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù)分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù)C文庫的優(yōu)勢與局限性文庫的優(yōu)勢與局限性 本方法適用于氨基酸殘基數(shù)目較少的本方法適用于氨基酸殘基數(shù)目較少的蛋白基因。蛋白基因。缺點：缺點： 2. 如目的基因如目的基因DNA序列需通過氨基酸序序列需通過氨基酸序 列推測，難于保證與天然基因序列一列推測，難于保證與天然基因序列一 致，往往導(dǎo)致表達(dá)效率大大降低。致，往往導(dǎo)致表達(dá)效率大大降低。使用使用DNA合成儀合成儀1. 只能合成較小片段的DNA四、化學(xué)合成法制備基因片段四、化學(xué)合成法制備基

25、因片段第四節(jié)目的基因的載體連接-接，分子克隆的核心一、一、PCR產(chǎn)物的克隆策略產(chǎn)物的克隆策略（一）限制性內(nèi)切酶酶切位點添加法（一）限制性內(nèi)切酶酶切位點添加法（二）（二）T/A克隆法克隆法定向克隆定向克隆將外源將外源DNA片段定向插入到載體中的方法片段定向插入到載體中的方法 對于雙向插入，如為擴(kuò)增型載體并對于雙向插入，如為擴(kuò)增型載體并無影響；無影響； 如為表達(dá)型載體，反向插入則可導(dǎo)如為表達(dá)型載體，反向插入則可導(dǎo)致不表達(dá)，故一定要保證正向插入致不表達(dá)，故一定要保證正向插入常用方法：雙酶切常用方法：雙酶切Nde ICATATGGTATACHindAAGCTTTTCGAATA克隆定義克隆定義 利用嗜熱

26、聚合酶如利用嗜熱聚合酶如Taq聚合酶的模板非依聚合酶的模板非依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性(在在7075活性高活性高)，使使PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的3末端加一個末端加一個A的粘性端，的粘性端，將其直接克隆至將其直接克隆至3粘性末端含一個粘性末端含一個T的線的線性克隆載體中性克隆載體中.35T載體載體35載體載體T3535AAPCR產(chǎn)物產(chǎn)物常規(guī)的克隆方法：常規(guī)的克隆方法：PCR產(chǎn)物產(chǎn)物載體載體酶切酶切酶切后酶切后PCR產(chǎn)物產(chǎn)物酶切后載體酶切后載體重組重組分子分子連接連接不足：不足：需要酶切需要酶切受酶切位點的限制受酶切位點的限制TA克隆方法克隆方法(一步一步PCR克隆克隆)PCR擴(kuò)增+335P

27、CR產(chǎn)物產(chǎn)物AA5T載體載體TT5533連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化藍(lán)白篩選藍(lán)白篩選校正聚合酶校正聚合酶平端平端PCR產(chǎn)物產(chǎn)物Taq酶酶dATP（一）粘性末端連接法（一）粘性末端連接法用同一種限制性內(nèi)切酶酶切DNA連接酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因適用于插適用于插入片段和入片段和載體具有載體具有相同的粘相同的粘性末端性末端高背景高背景(自身環(huán)化自身環(huán)化)多拷貝插入多拷貝插入雙向雙向(正、反正、反)插入插入單酶切單酶切缺陷缺陷二、外源二、外源DNA片段和載體的連接片段和載體的連接（二）平頭末端連接法質(zhì)粒產(chǎn)生平末端的內(nèi)切酶DNA連接酶產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶核酸酶S1目的基因重組質(zhì)粒產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶核酸酶S1 本法適

28、用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點?。ㄈ┤斯そ宇^法用同一種限制性內(nèi)切酶酶切DNA連接酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因+DNA連接酶接頭(linker) 本法適用于在質(zhì)粒和本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的目的基因上沒有相同的酶切位點酶切位點（四）同聚物接尾法DNA連接酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因內(nèi)切酶末端轉(zhuǎn)移酶 +dGTP末端轉(zhuǎn)移酶 +dCTP 本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點連接反應(yīng)：16，16h如何實現(xiàn)？第五節(jié)重組分子的擴(kuò)增和鑒定宿主細(xì)胞：被導(dǎo)入重組分子的細(xì)胞宿主細(xì)胞：被導(dǎo)入重組分子的細(xì)胞宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞原核細(xì)胞：大腸桿菌、鏈霉菌原核細(xì)胞：大腸桿菌、鏈霉菌 及枯草桿菌及枯草桿菌真

29、核細(xì)胞：酵母、昆蟲細(xì)胞及真核細(xì)胞：酵母、昆蟲細(xì)胞及哺乳動物細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞一、重組一、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞-轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)化原意：細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)特性由于受轉(zhuǎn)化原意：細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)特性由于受納了外源納了外源DNA而發(fā)生可遺傳的改變。而發(fā)生可遺傳的改變。 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重或以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程導(dǎo)入細(xì)菌的過程轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵：感受態(tài)細(xì)菌的制備轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵：感受態(tài)細(xì)菌的制備感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞-competent cell 用理化方法人工誘導(dǎo)細(xì)胞，使用理化方法人工誘導(dǎo)細(xì)胞，使之處

30、于易于吸收和容納外源之處于易于吸收和容納外源DNA分子的狀態(tài)，此時的細(xì)菌稱。分子的狀態(tài)，此時的細(xì)菌稱。轉(zhuǎn)化原理及轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染程序轉(zhuǎn)化原理及轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染程序大腸桿菌大腸桿菌膨脹成球形膨脹成球形CaCl204DNA抗抗DNA酶的羥基酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物鈣磷酸復(fù)合物附著附著細(xì)胞細(xì)胞表面表面42 90s熱休克熱休克細(xì)胞吸收細(xì)胞吸收復(fù)蘇復(fù)蘇分裂增殖分裂增殖原理原理化學(xué)轉(zhuǎn)化法化學(xué)轉(zhuǎn)化法重組質(zhì)粒的導(dǎo)入方法重組質(zhì)粒的導(dǎo)入方法 化學(xué)法：需感受態(tài)細(xì)胞化學(xué)法：需感受態(tài)細(xì)胞 電擊法：不需感受態(tài)細(xì)胞電擊法：不需感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化程序：轉(zhuǎn)化程序：對數(shù)生長對數(shù)生長期的細(xì)菌期的細(xì)菌CaCl204感受態(tài)細(xì)菌感受態(tài)細(xì)菌(4保存保存24

31、h)重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNA+細(xì)菌細(xì)菌430min熱休克熱休克(42,90s)普通培養(yǎng)普通培養(yǎng)基溫育基溫育涂布于含抗生素涂布于含抗生素的培養(yǎng)基平板的培養(yǎng)基平板單菌落單菌落倒置培養(yǎng)倒置培養(yǎng)37基因?qū)胙b置(Bio-Rad)噬菌體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞噬菌體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞體外包裝體外包裝在離體條件下，將提取的包裝蛋白與帶在離體條件下，將提取的包裝蛋白與帶COS位點的位點的DNA混合，產(chǎn)生噬菌體顆粒的混合，產(chǎn)生噬菌體顆粒的過程。過程。通過噬菌體的釋放和感染將通過噬菌體的釋放和感染將DNA從一個從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的過程。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)-transduction體外包裝體外包裝噬菌體的噬

32、菌體的頭部蛋白頭部蛋白完整的噬菌體顆粒完整的噬菌體顆粒DNA重組重組分子分子大腸桿菌大腸桿菌體外包裝液已商品化體外包裝液已商品化, 106噬菌斑噬菌斑/gDNA1034噬菌斑噬菌斑/gDNA二、重組二、重組DNA分子的鑒定分子的鑒定非轉(zhuǎn)化子非轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子非重組子非重組子重組子重組子鑒定鑒定（一）抗生素平板篩選（一）抗生素平板篩選-實為插入失活法實為插入失活法AmprTetrKanrAmpsTetsKans單抗生素篩選單抗生素篩選非轉(zhuǎn)化子非轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子陽性重組子陽性重組子自身環(huán)化載體自身環(huán)化載體未酶解完全載體未酶解完全載體非目的基因插入載體非目的基因插入載體僅作為初步篩選僅作為初步篩

33、選AmprTerr插入失活的雙抗生素對照篩選法用PstI酶切DNA連接酶重組質(zhì)粒目的基因AmprTetrPst I目的基因與pBR322經(jīng)PstI酶切后進(jìn)行重組如何篩選得到陽性克??？思考題思考題克隆克隆3,5,7,9,10 是陽性克隆是陽性克隆AmpTet平板平板123456789101112123456789101112TetTet轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子非轉(zhuǎn)化子非轉(zhuǎn)化子(不能生長不能生長)插入失活篩選法插入失活篩選法(120)（二）（二）X-gal篩選篩選-藍(lán)藍(lán)/白篩選白篩選見于見于pUC系列，系列， pEGM系列，系列，M13乳糖乳糖葡萄糖葡萄糖+半乳糖半乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（Z）-半乳糖苷酶基因來源半乳糖苷酶基因來源-Lac操縱子操縱子LacZ調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)序列載體中載體中編碼編碼-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N-末端末端146個個AA序列序列IPTG誘導(dǎo)誘導(dǎo)宿主編碼的宿主編碼的-半乳糖苷酶缺陷型基因半乳糖苷酶缺陷型基因+-半乳糖苷酶半乳糖苷酶AmprMCSLacZ在Laz中插入目的基因 X-gal藍(lán)色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因藍(lán)白斑篩選陽性克隆陰性克隆互補(bǔ)篩選法（互補(bǔ)篩選法（237）(三）酶切電泳鑒定三）酶切電泳鑒定瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳限制