沙門氏菌檢驗(yàn)

1、沙門氏菌檢驗(yàn)1. 范圍本法適用于食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)。2. 設(shè)備和材料處微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1冰箱：2C5C。2.2恒溫培養(yǎng)箱：36C士1C,42C士1C。2.3均質(zhì)器。2.4振蕩器。2.5電子天平：感量0.1g。2.6無菌錐形瓶：容量500mL250mL2.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。/1X2.8無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm2.9無菌試管：3mm<50mm10mm75mm2.10無菌毛細(xì)管。2.11pH計或pH比色管或精密pH試紙。2.12全白動微生物生化鑒定系統(tǒng)。培養(yǎng)基和試劑3.1緩沖蛋白

2、月東水（BPW。3.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液。3.3亞硒酸鹽胱氨酸（SQ增菌液。3.4亞硫酸秘'（B0瓊脂。僅供個人學(xué)習(xí)參考3.5HE瓊脂3.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD瓊脂3.7沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基。3.8三糖鐵（TSI）瓊脂。3.9蛋白月東水、靛基質(zhì)試劑。3.10尿素瓊脂（pH7.2）。3.11氧化鉀（KCN培養(yǎng)基。3.12賴氨酸脫短酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。3.13糖發(fā)酵管。3.14鄰硝基苯（3-D-半乳糖昔（ONPG培養(yǎng)基。3.15半固體瓊脂。3.16丙二酸鈉培養(yǎng)基。3.17沙門氏菌O和H診斷血清。/;I"z3.18生化鑒定試劑盒。4.檢驗(yàn)程序沙門氏菌檢驗(yàn)程序見圖1。42

3、C士1C,18h36C士125g(mL)樣品24h、36C士1C,18h24h36C士1C,40h；48h1mL+TTB136C彳1C,18h1mL+SC10圖1沙門氏菌檢驗(yàn)程序24h5.操作步驟XLD(或HE、顯挑取可置菌落5.1前增菌稱取25g（mD樣品放入盛有225mLBPW勺無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min10000r/min均質(zhì)1min2min,或置于盛有225mLBPW無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測定pH值，用1mol/mL無菌NaO成HCl調(diào)pH至6.8士0.2.無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可

4、直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36C士1C培養(yǎng)8h18h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45C以下不超過15min,或2C5C不超過18h解凍。5.2增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL轉(zhuǎn)種于10mLTTEft,于42C士1C培養(yǎng)18h24h。同時，另取1mL轉(zhuǎn)種于10mLSW,于36C士1C培養(yǎng)18h24h。5.3分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。與36C士1C分別培養(yǎng)18h24h（XL并板、HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h48h（BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落，各個平板上的菌落特征見表1。表1沙門

5、氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為褐色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可成黑色或棕色；有些菌株成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。HE瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。XLD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進(jìn)行判定。5.4生化試驗(yàn)5.4.1白選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可以菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種懶氨酸

6、脫短酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36C士1C培養(yǎng)18h24h,必要時可延長至48h。在三糖鐵瓊脂和懶氨酸脫短酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表2。表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和懶氨酸脫短酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果三糖鐵瓊脂懶氨酸脫短酶試驗(yàn)培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫KA+(-)+(-)+可疑沙門氏菌屬KA+(-)+(-)-可疑沙門氏菌屬AA+(-)+(-)+可疑沙門氏菌屬AA+/-+/-非沙門氏菌KK+/-+/-+/-非沙門氏菌注：K:產(chǎn)堿，A:產(chǎn)酸；+:陽性，一：陰性；+（-）:多數(shù)陽性，少數(shù)陰性；+/一:陽性或陰性。5.4.2接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫短酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時，可直接接種

7、蛋白月東水（供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂（pH7.2）、氧化鉀（KCN培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36C士1C培養(yǎng)18h24h,必要時可延長至48h,按表3判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲存于2C5C或室溫至少保留24h,以備比必要時復(fù)查。表3沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH7.2尿素割化鉀（KCN懶氨酸脫短酶A1+-+A2'+一一+A3-一一+/-注：+陽性；一陰性；+/一陽性或陰性。反應(yīng)序號A1:典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN懶氨酸脫短酶3項中有1項異常，按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。表4沙門

8、氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表pH7.2尿素割化鉀（KCN懶氨酸脫短酶判定結(jié)果-甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）-+沙門氏菌IV或V（要求符合本群生化特征）+-+沙門氏菌個別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）注：+表示陽性；一表示陰性。醇試驗(yàn)，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。隱形為沙門氏菌，同事賴氨酸脫短酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫短酶陰性。表5沙門氏菌屬生化群的鑒別項目InmIVVVI衛(wèi)矛醇+-+-山梨醇+一水楊首-+-一ONPG-+-+一丙二酸鹽一+-一KCN一-+一注：+表示陽性;一表示陰性。、尸5.4.3或全白動微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定

9、5.5血清學(xué)鑒定5.5.1抗原的準(zhǔn)備一般采用1.2%1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。O血清不凝集時，講菌株接種在瓊脂量較高的（如2吮3%）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了。凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.55%0.65%半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.3%0.4%半固體瓊脂的小試管1次2次，白遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。5.5.2多價菌體抗原（。鑒定再玻片上劃出2個約1cg2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其

10、中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體（?？寡?，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1min,并對著黑暗背景進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。5.5.3多價鞭毛抗原（H）鑒定5.5.4血清學(xué)分型（選做項目）用AF多價。血清做玻片凝集試驗(yàn)，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中白凝者為粗糙型菌株，不能分型。被AF多價O血清凝集者，依次用O4O3O1QO7;O&OQO2和O11因子血清做凝集試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，判定O群。被O3O10血清凝集的菌株，再用O1QO15O34O19單因子血清做凝集試驗(yàn)，判定E1、E2、E&

11、amp;E4各亞群，每一個?？乖煞值淖詈蟠_定均應(yīng)根據(jù)O單因子血清的檢查結(jié)果，沒有O單因子血清的要用兩/1x個O復(fù)合因子血清進(jìn)行核對。不被AF多價O血清凝集者，先用9種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝-Ip.L集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。每種多價O血清所包括的O因子如下：O多價1A,B,C,D,E,F群（并包括6,14群）。多價213,16,17,18,21群。多價328,30,35,38,39群。多價440,41,42,43群。多價544,45,47,48群。多價650,51,52,53群。多價755,56,57,58群。多價859,60,61,62群。多價963

12、,65,66,67群H抗原的鑒定屬于AF各。群的常見菌型，依次用表6所述H因子血清檢查第1相和第2項的H抗原。表2AF群常見菌型H抗原表O群第1相第2相ABBC1C2D（不產(chǎn)氣的）D（產(chǎn)氣的）E1E4E4ag,f,si,b,dk,v,r,cb,d,rdg,m,p,qh,vg,s,ti無-.無25, z152,5無1無6, w,x無不常見的菌型，先用8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以第1相和第2相的H抗原。8種多價H血清所包括的H因子如下：H多價1a,b,c,d,iH多價2eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,

13、gq,mt,gz51H多價3k,r,y,z,zio,1v,1w,1z13,lz28,lz40H多價41,2;1,5;1,6;1,7;z6H多價5z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38H多價6z39,z41,z42,z44H多價7z52,z53,z54,z55H多價8z56,z57,z60,z61,z62每一個H抗原成分的最后確定均應(yīng)根絕H單因子血清的檢查結(jié)果，沒有H單椅子血清的要用兩個H復(fù)合因子血清進(jìn)行核對。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的或檢出第2相H抗原而未檢出啊第1相H抗原的，可在瓊脂斜面上移種12代后再檢查。如仍只檢出一個相的H抗原,要用位相變異的方法

14、檢查其另一個相。單相菌不必做位相變異檢查。位相變異試驗(yàn)方法如下：小玻管法：將半固體管（每管約1mlH2mL）在酒精燈上溶化并冷至50C,取已知相的H因子血清0.05mL0.1mL,加入于溶化的半固體內(nèi)，混勻后，用毛細(xì)吸管吸取分裝于供位相變異試驗(yàn)的小玻管內(nèi)，俟凝固后，用接種針挑取待檢菌，接種于一端。將小玻管平放在平皿內(nèi)，并在其旁放一團(tuán)濕棉花，以防瓊脂中水分蒸發(fā)而干縮，每天檢查結(jié)果，待另一相細(xì)菌解離后，可以從另一端挑取細(xì)菌進(jìn)行檢查。培養(yǎng)基內(nèi)/1Z血清的濃度應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤^高時細(xì)菌不能生長，過低時同一相細(xì)菌的動力不能抑制。一般按原血清1:2001:800的量加入。小倒管法：將兩端開口的小玻管（下端開口要留一個缺口，不要平齊）放在半固體管內(nèi)，小玻管的上端應(yīng)高出于培養(yǎng)基的表面，滅菌后備用。臨用時在酒精燈上加熱融化，冷至50C，挑取因子血清1環(huán)，加入小套管中的半固體內(nèi)，略加攪動，使其混勻，俟凝固后，將待檢菌株接種于小套管中的半固體表層內(nèi)，每天檢查結(jié)果，待另一相細(xì)菌解離后，可從套管外的半固體表面取菌檢查，或轉(zhuǎn)種1%軟瓊脂斜面，于37C培養(yǎng)后再做凝集試驗(yàn)。簡易平板法：將0.35