色法流式細胞術(shù)檢測CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3的方法

1、.三色法流式細胞術(shù)檢測CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3的方法王琦1 張行1 邵雁2 陳大方1 陳萍1 曹江1目的 為探討甲狀腺患者外周血中Foxp3+CD4 T細胞的表達及在甲狀腺惡性腫瘤患者外周血手術(shù)前后的臨床意義。方法 建立流式細胞術(shù)檢測CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3的方法。 結(jié)果 外周血中Foxp3+CD4 T細胞平均比例，體檢健康組為3.7629±1.9996%，甲狀腺惡性腫瘤術(shù)前組為9.1492±6.4704%，術(shù)后組為7.4435±6.3587%。結(jié)論 甲狀腺惡性腫瘤患者Foxp3+CD4 T細胞平均比例明顯高于體檢健康者（P0.

2、05）。 而甲狀腺惡性腫瘤患者術(shù)后Foxp3+CD4 T細胞平均比例則低于術(shù)前。 關(guān)鍵詞: 流式細胞術(shù)、甲狀腺癌、Foxp3CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是天然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細胞的重要亞群之一，在穩(wěn)定的自身免疫環(huán)境中發(fā)揮重要的作用1。Foxp3特異性地表達在CD4+、CD25+Treg 細胞上，并在該細胞的發(fā)育和功能維持中起很重要的作用，進而提示Foxp3可能是CD4+、CD25+Treg 細胞的一個特征性標志2。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞有可能以某種機制抑制著機體對腫瘤的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生3，目前調(diào)節(jié)性T細胞與腫瘤免疫機制及治療的研究逐漸成為熱點。甲狀腺癌是最為常見的內(nèi)分泌惡性

3、腫瘤之一，占頭頸部腫瘤的首位，本研究為探討Foxp3+CD4 T細胞在甲狀腺惡性腫瘤患者外周血手術(shù)前后外周血中的表達，我們建立三色法流式細胞術(shù)檢測CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3的方法，并討論其臨床意義。1 材料與方法1.1臨床資料與分組： 收集甲狀腺癌患者（2007年11月2008年2月期間本院住院患者）外周血共41例，術(shù)前24例，其中的17例患者術(shù)后7天取外周血，行流式細胞術(shù)檢測CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3檢測，所有患者手術(shù)標本均經(jīng)組織病理學(xué)診斷。健康對照組21例，為本院體檢中心體檢健康者。1.2 主要試劑和儀器：淋巴細胞分離(國藥集團化學(xué)試機有限公司)，CD4-F

4、ITC、CD25-PE購自Caltag公司，F(xiàn)oxp3-PE-Cy5、IgG2a- PE-Cy5、 Foxp3破膜試劑盒等均購自eBioscience公司，正常大鼠血清購自杭州聯(lián)科有限公司。低溫高速離心機（HERAEUS D-37520 德國），流式細胞儀EPICS XL型 （Beckman Coulter 美國）。1.2 方法：1.2.1 外周血單個核細胞（PBMC）分離取患者外周靜脈血4ml以 EDTA抗凝，充分混勻。取10ml離心管，將4ml全血緩慢加在4ml淋巴細胞分離液上部，2000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心20分鐘。輕輕吸取中間白色的淋巴細胞層至另一管，2000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心5分鐘，去上清

5、。加2ml PBS混勻，2000轉(zhuǎn)/分室溫離心5分鐘，去上清。計數(shù)細胞后調(diào)整細胞濃度至1X106ml-1。1.2.2 流式樣本制備取200l上述單細胞懸液，在對照管和實驗管中分別加入100l，且在兩管中均加入CD4-Pcy5、CD25-FITC各5l，4避光孵育30分鐘。加1ml Flow cytometry Staining buffer，混勻。2000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心5分鐘，去上清。對照管和實驗管中各加入2ml破膜劑。4避光孵育45-60分鐘。2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，去上清。對照管和實驗管中各加入2ml Permeabilization Buffer，2000轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心5分鐘

6、，去上清。重復(fù)Permeabilization Buffer洗細胞步驟一次。對照管和實驗管各加入100 l Permeabilization Buffer，充分混勻，再加正常大鼠血清2l，4避光孵育15分鐘。無需Permeabilization Buffer清洗細胞，直接在對照管中加入IgG1-PE 2.5l，實驗管中加入Foxp3-PE 20l。4避光孵育至少30分鐘。對照管和實驗管中各加入2ml Permeabilization Buffer，2000轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心5分鐘。去上清，重復(fù)Permeabilization Buffer清洗步驟一次。加400ul Permeabilizati

7、on Buffer上機檢測。1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間差異以LSD法進行兩兩比較，P0.05為有顯著性差異。2.結(jié)果 2.1 甲狀腺惡性腫瘤手術(shù)前、后外周血中CD4+CD25+ T細胞的平均比例：流式細胞術(shù)檢測體檢健康者外周血中CD4+CD25+ T細胞的平均比例為22.4048±7.5827%，甲狀腺惡性腫瘤術(shù)前外周血中CD4+CD25+ T細胞的平均比例為19.7725±7.9942%，術(shù)后組為21.5765±9.1018%。無顯著性差異（P0.05）。2.2甲狀腺惡性腫瘤組術(shù)前Foxp3+CD4 T細胞的平均比例（9.1

8、492±6.4704%）, 明顯高于體檢健康者（3.7629±1.9996%），二者相比有顯著性差異（P0.05）。2.3 甲狀腺惡性腫瘤組進行腫瘤切除術(shù)后，外周血中的Foxp3+CD4 T細胞的平均比例（7.4435±6.3587%），而體檢健康者為（3.7629±1.9996%），二者相比有顯著性差異（P0.05）。2.4 甲狀腺惡性腫瘤術(shù)后組外周血中的Foxp3+CD4 T細胞的平均比例（7.4435±6.3587%）低于術(shù)前組（9.1492±6.4704%），無顯著性差異（P0.05）3. 討論:腫瘤的發(fā)生是腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)

9、測的結(jié)果，在腫瘤宿主體內(nèi)許多可以被自體T細胞識別的腫瘤相關(guān)抗原目前已經(jīng)被證明是自身的正常組分。通過外周耐受抑制自身反應(yīng)性T細胞活性的機制，也同樣影響著對腫瘤相關(guān)的自身抗原的應(yīng)答，從而參與腫瘤在宿主體內(nèi)發(fā)生和發(fā)展，而具有免疫調(diào)節(jié)潛力的CD4+ CD25+ 調(diào)節(jié)性T細胞就是限制自身免疫反應(yīng)的重要因素之一3、4。甲狀腺腫瘤是較常見的內(nèi)分泌腺腫瘤，臨床最初多表現(xiàn)為無痛性甲狀腺結(jié)節(jié)，在總?cè)巳褐械陌l(fā)病率為4%7%，其中大多數(shù)為良性，但約有5%為惡性5。 甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后是多種基因相互或獨立作用的結(jié)果，了解各種類型甲狀腺癌及其不同病程階段的基因和編碼蛋白表達變化，對于分析病變相關(guān)分子生物學(xué)具有重要的

10、意義6。本研究收集甲狀腺惡性腫瘤患組24例，甲狀腺切除術(shù)后組17例，體檢健康組21例，用三色法流式細胞術(shù)檢測外周血中CD4+CD25+ T細胞、Foxp3+CD4 T細胞的平均比例。結(jié)果表明，甲狀腺惡性腫瘤術(shù)前組、術(shù)后組和體檢健康組三組間CD4+CD25+ T細胞的平均比例經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理無顯著性差異。而甲狀腺惡性腫瘤組無論術(shù)前、術(shù)后Foxp3+CD4 T細胞的平均比例均高于體檢健康者（P0.05）。目前國內(nèi)外有報道腫瘤患者外周血和腫瘤組織中CD4+CD25+ 調(diào)節(jié)性T細胞升高，并且在腫瘤組織切除后外周血中CD4+CD25+ 調(diào)節(jié)性T細胞的水平有所下降。本實驗中甲狀腺惡性腫瘤術(shù)后組外周血中的Fox

11、p3+CD4 T細胞的平均比例（7.4435±6.3587%）低于術(shù)前組（9.1492±6.4704%），呈下降趨勢，與國內(nèi)外相關(guān)報道一致。為臨床提供了觀察患者手術(shù)療效的一個有效指標。流式細胞儀在分析細胞群體時具有速度快、多參數(shù)、細胞數(shù)量大等優(yōu)點，此方法檢測外周血在臨床上應(yīng)用非常廣泛，本實驗建立三色法檢測外周血中CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3的方法，可及時了解患者外周血中調(diào)節(jié)性T細胞表達水平的變化，為臨床觀察手術(shù)、藥物及基因治療等療效提供一定的依據(jù)，也可作為對患者預(yù)后的判斷和隨訪治療的參考。參考文獻：1. 呂凌。介導(dǎo)CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)育與功能的一

12、個關(guān)鍵基因-Foxp3J 。國際免疫學(xué)雜志，2006，29（2）：65-68。2. Fontenot JD, Gavin EW，Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+、CD25+ regulatory T cellsJ . Nat Immunol, 2003, 4(4):330-336.3. 崔永生，李欣，于春雷等.肺癌和乳腺癌患者外周血中CD4+ CD25+ T細胞及Foxp3 mRNA的變化特點及臨床意義J. 吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，32（5）：843-846。4. Sakaguchi S. Regulatory T cells : key controllers of immunologic self-toleranceJ.Cell, 2000, 101: 455-458.5. 許晨，趙文川.甲狀腺分子標記物研究進展J. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)