CRISPR操作系統(tǒng)(原理)

1、一圖看破CRISPR操作系統(tǒng)!近日，Cell 發(fā)表了一篇名為 “ Snap Shot: CRISPR -RNA-Guided AdaptiveImmune Systems 的精華文章，用一張圖，就全解析了CRISPR系統(tǒng)的 中心法那么。今天就讓麥子帶大家分解此圖，真正掌握時(shí)下這個(gè)可以對(duì)人、老鼠、斑 馬魚(yú)、細(xì)菌、果蠅、酵母、線蟲(chóng)和農(nóng)作物等細(xì)胞內(nèi)的基因進(jìn)行精確編輯的熱門(mén) 技術(shù)之精髓：細(xì)菌和古細(xì)菌已經(jīng)根據(jù) CRISPR規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)，Clustered regularly in terspaced short pali ndromic repeats位點(diǎn)和多樣化 CRISPR 相關(guān)CRIS

2、PR-associated ,Cas基因，進(jìn)化出了復(fù)雜的CRISPR適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)可以分為三種類(lèi)型:I-III及至少11種不同的亞型l-Al-F，II-AII-C， III-AIII-B。但是所有的CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)都是通過(guò)主要的三個(gè)階段來(lái)行 使功能：? 外來(lái)DNA的采集? CRISPR RNA的生物合成?靶向干擾第一階段：外來(lái) DNA 的采集Foreign DNA AcquisitionSTAGE 1: Fornign DNA «cqui«itiQn階Eft 戶jW-*"*JT卜來(lái)DMA的采蒔宿主通過(guò)Cas蛋白來(lái)識(shí)別外源核苷酸，入侵細(xì)

3、菌的短片段DNA稱(chēng)為protospacers，它們作為間隔區(qū)序列插入到了宿主的 CRISPR位點(diǎn)。在I和II 型系統(tǒng)中，protospacers選擇自入侵 DNA旁出現(xiàn)PAM的區(qū)域PAM : protospacer adjace nt motif ，對(duì)于 CRISPR 結(jié)合至關(guān)重要。一般 protospacers 通過(guò)包含Cas1、Cas2和游離3'-羥基等元件的機(jī)制連接在 CRISPR位點(diǎn)的前導(dǎo) 區(qū)(Leader)。Protospacer的整合也伴隨著末端重新序列復(fù)制，這可能涉及宿主 聚合酶和DNA修復(fù)機(jī)制。第二階段：CRISPR RNA 的生物合成crRNA Biogenesis

4、STAGE 士 crftNA bicgonefli* :T 二?介段：frRNA的牛fWillPre crflNATypellypo iiMature crRNAaCRISPRRNA的生物合成從轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，接下來(lái)是初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-crRNA加工生成一類(lèi)短的CRISPR衍生RNAscrRNAs，每一個(gè)都包含與之前遇到的外 源DNASpacer序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列。crRNA導(dǎo)向序列的兩側(cè)是相鄰重復(fù)序 列區(qū)域。在I型和III型系統(tǒng)中，初始CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會(huì)被CRISPR特異性核 酸內(nèi)切酶Cas6或Cas5d丨在重復(fù)序列位點(diǎn)內(nèi)切割。在許多I型系統(tǒng)中，重復(fù) 序列是回文結(jié)構(gòu)的，Cas6可以穩(wěn)定連接在

5、crRNA 3'端莖環(huán)上。而在III型系統(tǒng) 中，Cas6短暫與CRISPRRNA連接，crRNA的3'端會(huì)被未知的核酸酶進(jìn)一步 處理。CRISPRRNA的加工在II型系統(tǒng)中依賴(lài)于包含一個(gè)與重復(fù)序列互補(bǔ)序列的反式 作用crRNA (tracrRNA)。這些雙鏈的區(qū)域在 Cas9存在時(shí)可以被 RNaseIII加工, 靶向干擾需要tracrRNA和crRNA的同時(shí)存在。II型系統(tǒng)中的這兩個(gè)RNAs可 以融合成一個(gè)sgRNA，目前，II型系統(tǒng)是我們研究的 火力較為集中的系統(tǒng)，而 Cas9已經(jīng)變成了在多種細(xì)胞類(lèi)型和組織中靶向基因編輯的強(qiáng)大工具。第三階段：靶向干擾Target Interf

6、erenee Q Liable lype Flypo11 仃刊戲：科AJ成熟的crRNAs指導(dǎo)Cas蛋白到互補(bǔ)靶標(biāo)，靶序列由特異性的Cas核酸酶降解， 但不同的CRISPR系統(tǒng)降解機(jī)制存在差異：I型和II型系統(tǒng)都可以靶向包含PAM 和protospacer互補(bǔ)序列的dsDNA底物。在II型系統(tǒng)中，靶標(biāo)的降解是通過(guò)單 一的蛋白Cas9和兩個(gè)RNAs來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而在I型系統(tǒng)中，那么依賴(lài)于包含多個(gè)亞 型的復(fù)合物，可以結(jié)合dsDNA并招募Cas3，Cas3是一個(gè)反式作用的核酸酶， 經(jīng)常融合到依賴(lài)于ATP的解旋酶上。類(lèi)似于I型系統(tǒng)，山型系統(tǒng)也同樣依賴(lài)于 探測(cè)目標(biāo)的多亞基復(fù)合物，這些復(fù)合物展示出了內(nèi)源性核酸

7、酶活性，依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄方式降解互補(bǔ)的RNA、靶向DNA，不過(guò)III型系統(tǒng)不依賴(lài)于PAM進(jìn)行靶標(biāo)位點(diǎn) 的識(shí)別，而是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)向序列延伸至crRNA信號(hào)5'handle的核苷酸進(jìn)行識(shí)別CRISPR位點(diǎn)包含與導(dǎo)向序列，5'handle互補(bǔ)的序列，并阻止靶 向裂解。關(guān)閉頸環(huán)<5Type II(TCRI9V帕仙$S' Pra-crftNAPrimingacquisitionMr-CRfSPR gtfUKCRISPR LocusTyp<duDMA七Type Illi (Tatgec DNASTAGE 2： crRNA biogenesis在I型系統(tǒng)中，復(fù)合物靶向結(jié)

8、合會(huì)導(dǎo)致 Cas3介導(dǎo)的靶向降解直接干擾或最初采集，這其中涉及crRNA導(dǎo)向募集Cas3、Cas1和Cas2到外源DNA處, 引起新一輪的快速采集。II型系統(tǒng)中雖然未觀察到最初采集，但 Cas9是protospacer正確篩選的必要元件，這說(shuō)明在靶向干擾與外源DNA采集之間存在一種功能性聯(lián)系。近期，多種可以產(chǎn)生 anti-CRISPRs蛋白的病毒編碼基因已 經(jīng)證明了可以干擾CRISPR的不同階段，這將顛覆 CRISPRs系統(tǒng)。衍生閱讀：an ti-CRISPRsAcrF1AcrF2AcrF3在 9 月的 Nature 文章：“Multiplemechanisms for CRISPR -Cas inhibition by anti-CRISPRproteins 中，研究人員確定了三種 anti-CRISPR 蛋白：AcrF1、AcrF2 和AcrF3的功能機(jī)制，驗(yàn)證了它們通過(guò)不同的機(jī)制抑制CRISPR -Cas的活性。AcrF1、AcrF2可以通過(guò)與不同的蛋白質(zhì)亞基互作，