流式細(xì)胞術(shù)描述課件

1、流式細(xì)胞術(shù)描述流式細(xì)胞術(shù)Flow cytometry，F(xiàn)CM 第一頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述1. 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer):是現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技是現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技術(shù)、計算機技術(shù)于一體的先進科學(xué)技術(shù)設(shè)備。術(shù)、計算機技術(shù)于一體的先進科學(xué)技術(shù)設(shè)備。2. 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry):利用流式細(xì)胞儀對處利用流式細(xì)胞儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進行逐于快速直線流動狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進行逐個個(zhg)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)。術(shù)。基本概念基本概念第二頁

2、，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與原理流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與原理第二節(jié)第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析第三節(jié)第三節(jié) 流式細(xì)胞儀分析的技術(shù)要求流式細(xì)胞儀分析的技術(shù)要求(yoqi)(yoqi)第四節(jié)第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用第三頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 一、一、流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)(jigu)(jigu)與功能與功能 二、流式細(xì)胞術(shù)的重要術(shù)語二、流式細(xì)胞術(shù)的重要術(shù)語 三、三、流式細(xì)胞術(shù)基本原理流式細(xì)胞術(shù)基本原理 四、四、流式細(xì)胞術(shù)的樣本設(shè)置流式細(xì)胞術(shù)的樣本設(shè)置第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞儀基本流式細(xì)胞儀基本(jbn)(jbn)

3、結(jié)構(gòu)與原理結(jié)構(gòu)與原理第四頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 四、流式細(xì)胞術(shù)的樣本四、流式細(xì)胞術(shù)的樣本(yngbn)設(shè)置設(shè)置n1. 常用對照陰性對照陽性(yngxng)對照空白對照補償對照n2.一套完整的流式細(xì)胞術(shù)檢測樣本設(shè)置第五頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述陰性(ynxng)對照 作用是調(diào)節(jié)各熒光探測器合適的放大倍數(shù)，將儀器歸零，即確定待測標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值n免疫球蛋白同型對照免疫球蛋白同型對照（同型抗體為沒有(mi yu)特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白。反映待測標(biāo)本對抗體非特異性結(jié)合的 水平）n陰性細(xì)胞對照陰性細(xì)胞對照（用已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞進行平行實驗，通常用于確定抗體的特異性

4、）第六頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述陽性(yngxng)對照 即用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞(xbo)（陽性細(xì)胞(xbo)）細(xì)胞(xbo)進行平行實驗，通常用于檢測抗體是否有問題或確定實驗方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。第七頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述空白對照 即不進行標(biāo)記的細(xì)胞。有些細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)會同樣被激發(fā)(jf)而產(chǎn)生自發(fā)熒光?？瞻讓φ盏闹饕饔糜糜诖_定待測標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值或檢測染色方法是否成功。第八頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述補償(bchng)對照 由于光譜的重疊(chngdi)，對于多色分析樣本必須設(shè)置補償對照。補償對照主要用于多色分析時熒光光譜重疊(chngdi)的補償調(diào)節(jié)。 補償對照是將用于

5、多色標(biāo)記的各種熒光抗體分別與樣本反應(yīng)，一一進行單色標(biāo)記，以測定熒光信號的重疊并作適當(dāng)調(diào)節(jié)。第九頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述2.一套完整一套完整(wnzhng)的流式細(xì)胞術(shù)檢測樣本設(shè)置的流式細(xì)胞術(shù)檢測樣本設(shè)置 流式細(xì)胞術(shù)的基本原理是利用流式細(xì)胞術(shù)的基本原理是利用細(xì)胞標(biāo)記前后的熒光細(xì)胞標(biāo)記前后的熒光(ynggung)強度改強度改變變來確定細(xì)胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用于確定其基礎(chǔ)熒光域來確定細(xì)胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用于確定其基礎(chǔ)熒光域值的對照（如空白對照或陰性對照），又要有已標(biāo)記的待測樣本。一套值的對照（如空白對照或陰性對照），又要有已標(biāo)記的待測樣本。一套完整的流式樣本設(shè)置可根據(jù)

6、其不同的標(biāo)記方法進行如下設(shè)置。完整的流式樣本設(shè)置可根據(jù)其不同的標(biāo)記方法進行如下設(shè)置。 直接標(biāo)記樣本直接標(biāo)記樣本 對于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對照、陰性對照（同型抗體對照）對于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對照、陰性對照（同型抗體對照）和待測樣本。對于直接標(biāo)記多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補償對和待測樣本。對于直接標(biāo)記多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補償對照。照。 間接標(biāo)記樣本間接標(biāo)記樣本 對于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對照、陰性對照（一抗同型抗體對照）和待對于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對照、陰性對照（一抗同型抗體對照）和待測樣本。測樣本。 對于多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補償對照，一般不建議使用。對于多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補償對照，一

7、般不建議使用。第十頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述三、流式細(xì)胞術(shù)基本原理三、流式細(xì)胞術(shù)基本原理n1.1.流式細(xì)胞術(shù)分析的基本原理流式細(xì)胞術(shù)分析的基本原理n2.2.流式細(xì)胞術(shù)分選的基本原理流式細(xì)胞術(shù)分選的基本原理n3.3.流式細(xì)胞儀熒光流式細(xì)胞儀熒光(ynggung)(ynggung)補償設(shè)置補償設(shè)置第十一頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述1.流式細(xì)胞術(shù)分析(fnx)的基本原理n前向散射與側(cè)向散射是細(xì)胞前向散射與側(cè)向散射是細(xì)胞的固有屬性，暫稱為物理屬的固有屬性，暫稱為物理屬性。性。n熒光信號熒光信號(xnho)是人們通過不是人們通過不同手段將熒光物質(zhì)結(jié)合在細(xì)胞同手段將熒光物質(zhì)結(jié)合在細(xì)胞上，是人為屬性，

8、暫稱為化學(xué)上，是人為屬性，暫稱為化學(xué)屬性。屬性。第十二頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述R1：淋巴細(xì)胞R2：單核細(xì)胞R3：粒細(xì)胞R4：紅細(xì)胞裂解碎片(su pin)和少量血小板 將目的細(xì)胞群圈定將目的細(xì)胞群圈定(qun dn)（即設(shè)門），然后將門內(nèi)細(xì)胞以（即設(shè)門），然后將門內(nèi)細(xì)胞以FSC或或SSC為橫坐標(biāo)，為橫坐標(biāo)，熒光信號為縱坐標(biāo)的散點分布圖表示出來，此圖中細(xì)胞會出現(xiàn)在與其熒光信號為縱坐標(biāo)的散點分布圖表示出來，此圖中細(xì)胞會出現(xiàn)在與其FSC或或SSC相應(yīng)的相應(yīng)的位置，并只可能表現(xiàn)兩種情況：熒光信號弱或無、熒光信號強或有。位置，并只可能表現(xiàn)兩種情況：熒光信號弱或無、熒光信號強或有。 第十三頁，共六十

9、六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 調(diào)節(jié)電壓可改變目的細(xì)胞的熒光信號強弱，那么如何判斷特異性調(diào)節(jié)電壓可改變目的細(xì)胞的熒光信號強弱，那么如何判斷特異性熒光信號的有無？熒光信號的有無？ 需要設(shè)置陰性對照以確定細(xì)胞自身基礎(chǔ)需要設(shè)置陰性對照以確定細(xì)胞自身基礎(chǔ)(jch)熒光域值，并通過它熒光域值，并通過它來判斷待測樣本中是否有特異性熒光信號。來判斷待測樣本中是否有特異性熒光信號。 第十四頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 首先通過調(diào)節(jié)電壓將陰性對首先通過調(diào)節(jié)電壓將陰性對照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值調(diào)至陰性照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值調(diào)至陰性致信區(qū)內(nèi)致信區(qū)內(nèi)(q ni)(q ni)，然后對陰性置，然后對陰性置信區(qū)進行界定，大于陰性置信區(qū)信

10、區(qū)進行界定，大于陰性置信區(qū)的熒光信號為特異性熒光信號。的熒光信號為特異性熒光信號。 對于流式樣本來說，設(shè)置陰性對于流式樣本來說，設(shè)置陰性對照是必須的，且陰性置信區(qū)一旦對照是必須的，且陰性置信區(qū)一旦設(shè)定，將作為后續(xù)樣本的陰、陽性設(shè)定，將作為后續(xù)樣本的陰、陽性判斷的基礎(chǔ)，不能隨意變動。判斷的基礎(chǔ)，不能隨意變動。第十五頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述2.流式細(xì)胞術(shù)分選的基本原理1. 分選速度：幾千個細(xì)胞分選速度：幾千個細(xì)胞/秒秒2. 分選純度分選純度: 99.5%左右左右(zuyu) 分離后的樣品中該亞群細(xì)胞所占的百分比。分離后的樣品中該亞群細(xì)胞所占的百分比。3. 分選收獲率分選收獲率: 90-95%

11、 分離后所得的細(xì)胞亞群數(shù)占原細(xì)胞樣品中該亞群細(xì)胞數(shù)的百分離后所得的細(xì)胞亞群數(shù)占原細(xì)胞樣品中該亞群細(xì)胞數(shù)的百分比。分比。第十六頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述3.3.流式細(xì)胞儀熒光補償流式細(xì)胞儀熒光補償(bchng)(bchng)設(shè)置設(shè)置以以FITC、PE雙色分析為例：雙色分析為例：（1）先調(diào)節(jié)陰性對照管（即同型對照）先調(diào)節(jié)陰性對照管（即同型對照IgGFITC、IgGPE）：先將原補償）：先將原補償清零，通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群落清零，通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群落(qnlu)在在FITC和和PE雙陰性區(qū)。陰性雙陰性區(qū)。陰性對照的作用是，調(diào)節(jié)各熒光探測器合適的放大倍數(shù)，即歸零。對照的作用是，調(diào)節(jié)各熒光探測

12、器合適的放大倍數(shù)，即歸零。第十七頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述（2）FITC標(biāo)記標(biāo)記(bioj)抗體抗體/IgGPE：(IgGPE為同型對照為同型對照) 此時電壓已通過陰此時電壓已通過陰性對照設(shè)定，絕不能變動。當(dāng)性對照設(shè)定，絕不能變動。當(dāng)PE探測器檢測到的探測器檢測到的FITC信號恰好完全消信號恰好完全消除時，補償便是正確的，即除時，補償便是正確的，即FITC單陽性細(xì)胞的單陽性細(xì)胞的PE信號與陰性對照的信號與陰性對照的PE信號一致。信號一致。 注：首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，其次是在檢測管中，必須要有注：首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，其次是在檢測管中，必須要有FITC單陽性細(xì)胞和雙陰性細(xì)胞。單陽

13、性細(xì)胞和雙陰性細(xì)胞。第十八頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述第十九頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述（3）IgGFITC/PE標(biāo)記抗體：同理，將進入FITC探測器的PE信號降至本底一致，前提是必須有PE單陽性細(xì)胞和雙陰性細(xì)胞。（4）當(dāng)設(shè)置好以上(yshng)補償條件后，即補償調(diào)節(jié)完畢。第二十頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述（5）進行多色分析時，必須(bx)做各熒光間的補償。方法同上，先準(zhǔn)備各種標(biāo)記的熒光陰性對照，確定合適的電壓，并逐一調(diào)節(jié)各熒光標(biāo)記抗體，與其他熒光對照，然后調(diào)節(jié)特異性熒光對每個熒光的補償。第二十一頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述二、流式細(xì)胞術(shù)的重要二、流式細(xì)胞術(shù)的重要(zhngyo)術(shù)語術(shù)

14、語n1.1.前向散射與側(cè)向散射前向散射與側(cè)向散射n2. Coulter2. Coulter效應(yīng)與電子體積效應(yīng)與電子體積(tj)(tj)n3.3.熒光信號及其面積與寬度熒光信號及其面積與寬度n4.4.光譜重疊與熒光補償光譜重疊與熒光補償n5.5.細(xì)胞基礎(chǔ)熒光域值與陰性對照置信區(qū)間細(xì)胞基礎(chǔ)熒光域值與陰性對照置信區(qū)間第二十二頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述1.前向散射(snsh)與側(cè)向散射(snsh)前向散射光前向散射光 (forward scatter)(forward scatter)： FSCFSC信號的強弱與細(xì)胞的大小相關(guān)信號的強弱與細(xì)胞的大小相關(guān)側(cè)向側(cè)向(c xin)(c xin)散射光（散

15、射光（side scatter)side scatter)： SSCSSC信號的強弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān)信號的強弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān)第二十三頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述第二十四頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 利用前向角和利用前向角和測向角散射光可測向角散射光可以把外周血白細(xì)以把外周血白細(xì)胞分成胞分成(fn chn)三群，淋三群，淋巴細(xì)胞、單核巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。細(xì)胞和粒細(xì)胞。散射光的測定散射光的測定(cdng)第二十五頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述2.Coulter效應(yīng)(xioyng)與電子體積 Coulter Coulter效應(yīng)原理：微小效應(yīng)原理：微小(wixio)(wixio

16、)粒子并不導(dǎo)電，但通粒子并不導(dǎo)電，但通過充滿電解液的小孔時可產(chǎn)生過充滿電解液的小孔時可產(chǎn)生電阻變化，細(xì)胞體積越大，電電阻變化，細(xì)胞體積越大，電阻的改變越大?？蓪㈦娮枳兓璧母淖冊酱??？蓪㈦娮枳兓涗洖殡娢蛔兓?，用于微小記錄為電位變化，用于微小(wixio)(wixio)粒子體積測量和計數(shù)粒子體積測量和計數(shù)上。采用這種方法計算該顆粒上。采用這種方法計算該顆粒的體積就是電子體積。的體積就是電子體積。第二十六頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述3.熒光(ynggung)信號及其面積與寬度熒光信號被光電倍增管收集，形成信號脈沖，每個信號脈沖都有其高度、面積熒光信號被光電倍增管收集，形成信號脈沖，每個信號脈沖

17、都有其高度、面積與寬度。每種顏色的熒光占用一個與寬度。每種顏色的熒光占用一個(y )特定的檢測器，每種顏色的檢測器特定的檢測器，每種顏色的檢測器稱為一個稱為一個(y )熒光通道。熒光通道。脈沖高度表示熒光信號的強度，表示為脈沖高度表示熒光信號的強度，表示為FLn-Height，n為儀器的熒光收集器序數(shù)。為儀器的熒光收集器序數(shù)。脈沖面積（脈沖面積（FLn-A）是采用積分計算的熒光通量。（熒光脈沖面積比高度更能準(zhǔn)確）是采用積分計算的熒光通量。（熒光脈沖面積比高度更能準(zhǔn)確反映反映DNA含量，用于含量，用于DNA倍體分析）倍體分析）脈沖寬度（脈沖寬度（FLn-W）反映熒光的分布，）反映熒光的分布，常用

18、來區(qū)分雙連體細(xì)胞常用來區(qū)分雙連體細(xì)胞。第二十七頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述第二十八頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述4.光譜(gungp)重疊與熒光補償 利用電子技術(shù)或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光利用電子技術(shù)或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光(ynggung)(ynggung)通道的通道的信號加以扣除的技術(shù)稱信號加以扣除的技術(shù)稱“熒光補償熒光補償”第二十九頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述5.細(xì)胞基礎(chǔ)熒光域值與陰性(ynxng)對照置信區(qū)間對于對于(duy)流式樣本，由于細(xì)胞的自發(fā)熒光、熒光抗體會與待測標(biāo)本中的細(xì)胞發(fā)生少流式樣本，由于細(xì)胞的自發(fā)熒光、熒光抗體會與待測標(biāo)本中的細(xì)胞發(fā)生少量非特異性結(jié)合，

19、在流式細(xì)胞儀上可檢出一定的信號，這部分信號稱為基礎(chǔ)熒光量非特異性結(jié)合，在流式細(xì)胞儀上可檢出一定的信號，這部分信號稱為基礎(chǔ)熒光域值。域值。在流式標(biāo)本檢測過程中，通常需要通過調(diào)節(jié)電壓將陰性細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值在流式標(biāo)本檢測過程中，通常需要通過調(diào)節(jié)電壓將陰性細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值置于置于95%或或99%的置信區(qū)間內(nèi)，作為陰性對照可信區(qū)間設(shè)定。的置信區(qū)間內(nèi)，作為陰性對照可信區(qū)間設(shè)定。第三十頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述一、流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)一、流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)(jigu)與功與功能能n1. 流式細(xì)胞儀基本流式細(xì)胞儀基本(jbn)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)n2. 流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用第三十一頁

20、，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述2. 流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用(yngyng)n定性或定量分析功能定性或定量分析功能細(xì)胞膜：細(xì)胞膜：細(xì)胞表面抗原，表面糖類細(xì)胞表面抗原，表面糖類(tn li)(tn li)，表面受體，膜電位，表面受體，膜電位，膜結(jié)合鈣離子，細(xì)胞表面電荷等，這對確定細(xì)胞的性質(zhì)及其功能重膜結(jié)合鈣離子，細(xì)胞表面電荷等，這對確定細(xì)胞的性質(zhì)及其功能重要。要。細(xì)胞質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)：各種細(xì)胞成分，包括蛋白質(zhì)、各種細(xì)胞成分，包括蛋白質(zhì)、RNARNA、各種細(xì)胞器中的特殊成、各種細(xì)胞器中的特殊成分、各種抗原、基因編碼蛋白、細(xì)胞因子等。分、各種抗原、基因編碼蛋白、細(xì)胞因子等。細(xì)胞核

21、：細(xì)胞核：DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)等、蛋白質(zhì)等n分選功能分選功能可將具有特定性狀或功能的細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分離出來，可將具有特定性狀或功能的細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分離出來，再進行分析或培養(yǎng)。優(yōu)點：分選純度高（可達(dá)再進行分析或培養(yǎng)。優(yōu)點：分選純度高（可達(dá)99%99%），分選），分選回收率高，可分選活細(xì)胞?；厥章矢?，可分選活細(xì)胞。第三十二頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述1. 流式細(xì)胞儀基本流式細(xì)胞儀基本(jbn)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)n流動室與液流系統(tǒng)流動室與液流系統(tǒng)n光源與光學(xué)系統(tǒng)光源與光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)光源激發(fā)光源光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)n信號收集與光電轉(zhuǎn)換信號收集與光電轉(zhuǎn)換(zhunhun)系統(tǒng)系統(tǒng)n計算機與分析系

22、統(tǒng)計算機與分析系統(tǒng)第三十三頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述流動流動(lidng)室與室與液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)第三十四頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述PMTPMTPMTPMT二分二分(r fn)鏡鏡帶通濾光片帶通濾光片激光激光(jgung)1234Flow cell 由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件組成，它由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件組成，它們分別將不同們分別將不同(b tn)波長的光信號送入到不同波長的光信號送入到不同(b tn)的探測器。濾光片主要分為四類：的探測器。濾光片主要分為四類：長通濾光片長通濾光片（LP）、短通濾光片（）、短通濾光片（SP）、帶通濾光）、帶通濾光片（片（BP

23、）和）和二分鏡二分鏡光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 第三十五頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述第三十六頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述第三十七頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述激發(fā)光源n激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向(fngxing)、同步的穩(wěn)定光照n激光波長: 臺式機為固定波長488nm, 633nm ，大型機波長譜線寬包括325，457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm第三十八頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述信號收集與光電轉(zhuǎn)換信號收集與光電轉(zhuǎn)換(zhunhun)系統(tǒng)系統(tǒng) 主要由光電轉(zhuǎn)換器件、放大器和信號處理電路組成主要由光電轉(zhuǎn)換器件、

24、放大器和信號處理電路組成n光電轉(zhuǎn)換器件主要功能光電轉(zhuǎn)換器件主要功能(gngnng)(gngnng)是將光信號轉(zhuǎn)換成電流是將光信號轉(zhuǎn)換成電流信號。由光電二極管和光電倍增管（信號。由光電二極管和光電倍增管（PMTPMT）來執(zhí)行。）來執(zhí)行。n放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。n信號處理系統(tǒng)的主要功能是將電信號轉(zhuǎn)變成脈沖信號、數(shù)信號處理系統(tǒng)的主要功能是將電信號轉(zhuǎn)變成脈沖信號、數(shù)字信號最終傳送給計算機系統(tǒng)進行處理。字信號最終傳送給計算機系統(tǒng)進行處理。第三十九頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述計算機與分析計算機與分析(fnx)系統(tǒng)系統(tǒng)n計算機系統(tǒng)用于控制整個儀器的運行，數(shù)據(jù)(

25、shj)采集和數(shù)據(jù)(shj)分析。n各公司所產(chǎn)的流式細(xì)胞儀都有自己特有的分析系統(tǒng)。第四十頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述第二節(jié)第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析n一、參數(shù)前向散射光前向散射光FSC: 反映顆粒的大小反映顆粒的大小(dxio)側(cè)向散射光側(cè)向散射光SSC: 細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度熒光熒光FL: 細(xì)胞被染上熒光部分?jǐn)?shù)量的多少細(xì)胞被染上熒光部分?jǐn)?shù)量的多少n二、數(shù)據(jù)的顯示與分析n三、設(shè)門第四十一頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述二、數(shù)據(jù)的顯示(xinsh)與分析n1.單參數(shù)單參數(shù)(cnsh)直方圖直方圖n2.二維散點圖二維散點圖n3.二維等高線圖二維等高線圖n4

26、.假三維圖假三維圖n5.三維圖三維圖第四十二頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 以分布直方圖以分布直方圖( distribution histogram )( distribution histogram )來顯示，橫軸為該參來顯示，橫軸為該參數(shù)測量強度相對值，單位是道數(shù)。強度分布可以數(shù)測量強度相對值，單位是道數(shù)。強度分布可以(ky)(ky)是線性的，也可是線性的，也可以以(ky)(ky)是對數(shù)的。縱軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)是對數(shù)的?？v軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。1.1.單參數(shù)單參數(shù)(cnsh)(cnsh)直方圖直方圖第四十三頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述看圖技巧：看圖技巧：1.1.先看

27、橫、縱坐標(biāo)，了解檢測目的；先看橫、縱坐標(biāo)，了解檢測目的；2.2.看圖形分布，直方圖峰形越往右移，代表其熒光強度越強；看圖形分布，直方圖峰形越往右移，代表其熒光強度越強；3.M13.M1的確定的確定(qudng)(qudng)是根據(jù)陰性對照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值設(shè)定的，峰形右移，熒光是根據(jù)陰性對照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值設(shè)定的，峰形右移，熒光信號大于基礎(chǔ)熒光域值（信號大于基礎(chǔ)熒光域值（M1M1），表示陽性（），表示陽性（M2M2）；）；4.4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，檢測目的物一般用各數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，檢測目的物一般用各MarkerMarker區(qū)內(nèi)的細(xì)胞所占百分比或用平均熒光區(qū)內(nèi)的細(xì)胞所占百分比或用平均熒光強度表示；強度表

28、示；5.5.幾個直方圖的比較，關(guān)鍵看幾個直方圖的比較，關(guān)鍵看MarkerMarker（M1M1、M2M2）的位置以及細(xì)胞數(shù)。）的位置以及細(xì)胞數(shù)。第四十四頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 能夠顯示兩個獨立參數(shù)與細(xì)胞相對數(shù)之間的關(guān)系能夠顯示兩個獨立參數(shù)與細(xì)胞相對數(shù)之間的關(guān)系(gun x)(gun x)，橫、，橫、縱坐標(biāo)分別代表兩個獨立參數(shù)，平面上每一個點表示具有相應(yīng)坐標(biāo)縱坐標(biāo)分別代表兩個獨立參數(shù)，平面上每一個點表示具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞。值的細(xì)胞。2.二維散點圖二維散點圖第四十五頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述看圖技巧：1.先看x，y軸，了解代表參數(shù)的意義；2.再看其四個象限，并了解各象限意義；3.比較

29、幾個散點圖時，關(guān)鍵看四象限劃分區(qū)間的位置以及各象限散點的密度；4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，檢測目的物一般(ybn)用各象限區(qū)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)占門內(nèi)細(xì)胞百分比或用平均熒光強度表示。第四十六頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 用等高線來表示細(xì)胞用等高線來表示細(xì)胞(xbo)(xbo)數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞(xbo)(xbo)數(shù)相數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。3.二維等高線圖二維等高線圖第四十七頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 縱軸與橫軸分別代表縱軸與橫軸分別代表(dibio)(dibio)被測細(xì)胞的兩個測量參被測細(xì)胞的兩個測量參數(shù)數(shù),Z,Z軸為細(xì)胞數(shù)。軸為細(xì)胞數(shù)。4

30、. .假三維圖假三維圖第四十八頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述5.5.三維圖三維圖 任意選三個參數(shù)為任意選三個參數(shù)為x x，y y，z z軸，構(gòu)成一個三維圖，每一群細(xì)胞根據(jù)軸，構(gòu)成一個三維圖，每一群細(xì)胞根據(jù)各自參數(shù)處于一個相對獨立的空間各自參數(shù)處于一個相對獨立的空間(kngjin)(kngjin)，三維圖對比較復(fù)雜的亞群，三維圖對比較復(fù)雜的亞群的顯示更為直觀明了。的顯示更為直觀明了。第四十九頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述三、設(shè)門流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析的目的是通過與適當(dāng)?shù)年幮詫φ者M行比較，流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析的目的是通過與適當(dāng)?shù)年幮詫φ者M行比較，來確定所分析樣本中表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞百分率。完成這一過程的第

31、一來確定所分析樣本中表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞百分率。完成這一過程的第一步就是需要確定我們所要研究的目的細(xì)胞群，其術(shù)語為設(shè)門步就是需要確定我們所要研究的目的細(xì)胞群，其術(shù)語為設(shè)門（gatinggating）。）。設(shè)門是指在細(xì)胞分布圖中指定某一個范圍或某一細(xì)胞性狀的細(xì)設(shè)門是指在細(xì)胞分布圖中指定某一個范圍或某一細(xì)胞性狀的細(xì)胞群，并對其進行單參數(shù)或多參數(shù)分析。胞群，并對其進行單參數(shù)或多參數(shù)分析。根據(jù)根據(jù)(gnj)(gnj)散射光設(shè)門散射光設(shè)門根據(jù)某一細(xì)胞性狀設(shè)門根據(jù)某一細(xì)胞性狀設(shè)門組合設(shè)門組合設(shè)門第五十頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述第五十一頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 一、一、樣品樣品(yngpn)(yngp

32、n)制備：單細(xì)胞懸液制備：單細(xì)胞懸液 二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色 三、質(zhì)量控制三、質(zhì)量控制第三節(jié)第三節(jié) 流式細(xì)胞儀免疫流式細(xì)胞儀免疫(miny)(miny)分析的技術(shù)要分析的技術(shù)要求求第五十二頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述一一、樣品、樣品(yngpn)(yngpn)制備制備流式細(xì)胞儀的樣品要求：流式細(xì)胞儀的樣品要求： 單細(xì)胞懸液，避免任何單細(xì)胞懸液，避免任何(rnh)(rnh)細(xì)胞沉積細(xì)胞沉積 被檢細(xì)胞或顆粒大小被檢細(xì)胞或顆粒大小0.20.240um40um 樣品中至少樣品中至少2000020000個細(xì)胞，濃度個細(xì)胞，濃度10105 5-10-

33、106 6個個/ /毫升毫升第五十三頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述（一）外周血淋巴細(xì)胞樣品（一）外周血淋巴細(xì)胞樣品(yngpn)(yngpn)的制備的制備 利用紅細(xì)胞裂解利用紅細(xì)胞裂解(li ji)液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散點圖的流式細(xì)胞分析的二維散點圖第五十四頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，然后離心漂洗。使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，然后離心漂洗。 懸浮懸浮(xunf)(xunf)培養(yǎng)細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備培養(yǎng)

34、細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細(xì)胞懸液。成單細(xì)胞懸液。（二（二) ) 培養(yǎng)細(xì)胞的樣品培養(yǎng)細(xì)胞的樣品(yngpn)(yngpn)制備制備第五十五頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 機械法：機械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。 酶處理酶處理(chl)法：法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。 化學(xué)試劑處理法：化學(xué)試劑處理法：EDTA、EGTA等。等。 表面活性劑處理法：表面活性劑處理法： Triton-100、皂素等。、皂素等。(三三)新鮮新鮮(xn xin)實體組織單細(xì)胞懸液的制備實體組織單細(xì)胞懸液的制備第五十六頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 機械

35、法機械法往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞產(chǎn)量。的細(xì)胞產(chǎn)量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團塊等，如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團塊等，也可利用電子學(xué)技術(shù)處理的方法排除也可利用電子學(xué)技術(shù)處理的方法排除(pich)(pich)團塊和碎片團塊和碎片的干擾。的干擾。 酶學(xué)法、化學(xué)法酶學(xué)法、化學(xué)法對實體組織的分散效果較理想，但會造對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學(xué)成份的不良影響。成所測化學(xué)成份的不良影響。FCMFCM所測細(xì)胞是單個分散狀態(tài)；所測細(xì)胞是單個分散狀態(tài)；對細(xì)胞團塊，細(xì)胞碎片盡可能少；細(xì)胞的活性不受損害，對細(xì)胞團塊，細(xì)胞碎片盡可能

36、少；細(xì)胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光染色處理不受影響。以保證下一步的熒光染色處理不受影響。 第五十七頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述防止防止(fngzh)(fngzh)細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：1 1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2 2、乙醇與甲醇保存法：、乙醇與甲醇保存法：70%70%冷乙醇、冷乙醇、75%75%的甲醇。的甲醇。3 3、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但 細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響。細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響。

37、( (四）單細(xì)胞懸液的保存四）單細(xì)胞懸液的保存(bocn)(bocn)第五十八頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 染料的選擇和標(biāo)記染色保證了熒光染料的選擇和標(biāo)記染色保證了熒光(ynggung)信號的產(chǎn)生信號的產(chǎn)生（一）免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光染料（一）免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光染料熒光熒光(ynggung)染料染料 激發(fā)波長（激發(fā)波長（nm) 發(fā)射波長（發(fā)射波長（nm) 顏色顏色FITC 488 525 深藍(lán)色PE(RDI) 488 575 橙色(chn s)ECD 488 620 橙紅色PeCy-5 488 670 紅色PeCy-7 488 755 深紅色PI 488 620 橙紅色APC 633

38、 670 紅色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色第五十九頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光(ynggung)染料產(chǎn)生的熒光信號。染料產(chǎn)生的熒光信號。LaserCY5PECY5CY5488nm能量能量(nngling)傳遞染傳遞染料：料：第六十頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述熒光染料與細(xì)胞成分的結(jié)合方式：熒光染料與細(xì)胞成分的結(jié)合方式： 結(jié)構(gòu)親和方式結(jié)構(gòu)親和方式 嵌入嵌入(qin r)結(jié)合方式結(jié)合方式 共價結(jié)合方式共價結(jié)合方式 熒光抗體特異性結(jié)合方式熒光抗體特異性結(jié)合方式1、直接免疫熒光染色、直接免疫熒光染色2、間接免疫熒光染色、間接免疫熒光染色（二）免疫熒光標(biāo)記（二）免疫熒光標(biāo)記(bioj)第六十一頁，共六十六頁。流式細(xì)胞術(shù)描述3、雙或多參數(shù)熒光抗體、雙或多參數(shù)熒光抗體(kngt)的組合標(biāo)記的組合標(biāo)記FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色綠色、橙色(chn s